《人体血液中6种免疫抑制类药物含量的测定 高效液相色谱-串联质谱法》.pdfVIP

人体血液中6种免疫抑制类药物含量的测定

高效液相色谱-串联质谱法

1范围

本文件规定了人体血液中6种免疫抑制类药物含量的高效液相色谱-串联质谱检测方法。

本文件适用于人体血液中霉酚酸、霉酚酸酯、他克莫司、雷帕霉素、依维莫司和吡美莫司含量

的测定。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文

件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法。

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4原理

样品经乙酸乙酯提取、无水硫酸镁盐析、乙二胺-丙基硅烷净化后，涡旋混匀，冷冻离心，氮吹复溶，

进行液相色谱-串联质谱法测定，外标法定量。

5试剂和材料

5.1试剂和材料

除另有规定外，试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。

5.1.1乙腈：色谱纯。

5.1.2甲酸：色谱纯。

5.1.3乙酸：色谱纯。

1

5.1.4甲醇：色谱纯。

5.1.5丙酮：色谱纯。

5.1.6乙酸乙酯：色谱纯。

5.1.7无水硫酸镁。

5.1.8N-丙基乙二胺吸附剂（PSA）。

5.1.9石墨化碳

5.1.10标准品：霉酚酸（CAS号：24280-93-1）；霉酚酸酯（CAS号：115007-34-6）；他克莫司

（CAS号：104987-11-3）；雷帕霉素（CAS号：53123-88-9）；依维莫司（CAS号：159351-69-6）；

吡美莫司（CAS号：137071-32-0）的纯度均大于等于98%。

5.1.11混合标准储备溶液的配制：分别称取霉酚酸、霉酚酸酯、他克莫司、雷帕霉素、依维莫司和吡美

莫司1mg（精确到0.01mg)，置10mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，分别配制成500µg/mL

的霉酚酸、霉酚酸酯、他克莫司、雷帕霉素、依维莫司和吡美莫司储备溶液，于-20℃保存至分析。

5.1.120.1%甲酸水溶液：准确移取甲酸1.0mL置于1L量瓶中，用水定容，混匀。

6仪器设备

6.1液相色谱-串联质谱仪：配备电喷雾离子源（ESI）。

6.2氮吹浓缩仪。

6.3涡旋振荡器。

6.4电子分析天平（精度0.01mg）。

6.5高速冷冻离心机（最低转速12000rpm）。

7试样制备

全部血液样本充分混匀后，在4℃、3000r/min条件下离心10min，取管内上清液分装，-80℃储存待

测。

8试验步骤

8.1试样预处理

2

取500μL血液试样（7）和2.0mL乙酸乙酯于5mL离心管中，准确加入350mg无水MgSO、50mg

4

PSA进行盐析和净化，涡旋混匀30s后，经12000r/min，4℃冷冻离心10min。上清液全部取出，氮吹浓

缩至干，用甲醇复溶。涡旋混匀30s，过0.22μm微孔滤膜，待测定。

8.2标准曲线

取相应的空白样品，按照7步骤进行处理，用得到的空白样品提取液，将混合标准储备溶液逐级稀释，

得到他克莫司、雷帕霉素、依维莫司和吡美莫司浓度为1、5、20、50、75和100ng/mL；霉酚酸

酯浓度为0.1、0.5、2、5、7.5和10ng/mL；霉酚酸浓度为10、50、200、500、750和1000ng/mL

的系列混合标准工作溶液。浓度由低到高进行检测，以定量离子峰面积对质量浓度作图，做出标准曲线回

归方程。

8.3仪器参考条件

8.3.1液相色谱参考条件

a.色谱柱：AgilentPoroshell120EC-C18（3.0×50mm，2.7μm），或相当者。

b.流动相：A相