高级生化实验报告.pdfVIP

实验一血清γ球蛋白的分离纯化

一、实验目的与要求

1.掌握分离纯化蛋白质的基本原理和基本过程

2.熟悉盐析、离心、层析、电泳等生物化学基本技术在蛋白质分离纯化中的综

合应用。

3.学会设计和制定分离纯化蛋白质的实验方法、技术路线和质量监控和保证措

施。

二、实验原理

血清蛋白有3000多种，可粗略分为清、球蛋白两大类，球蛋白只是球蛋白

中的一个亚类。欲用常规方法获得，可先用半不饱和硫酸铵从血清中盐析出球蛋

白，接着用葡聚糖凝胶G-25层析柱（Sephadex-25）脱去球蛋白中的盐分（硫酸

铵），最后用DEAE（二乙基氨基乙基）纤维离子交换层析住，便可直接从脱盐

的球蛋白溶液中分离纯化出γ球蛋白。原理如下图所示：

三、实验步骤

γ球蛋白的分离纯化

1.3mL，4℃预冷血清，加入3mL4℃预冷的饱和硫酸铵（边加边混匀），静

置10min。

2.3500rpm离心15min，弃上清，沉淀溶于少量的水，留0.5mL测[Pr]。

3.上SephadexG-25柱，0.02mol·L－1pH6.5的NHAC缓冲液洗脱，每管收集

4

2mL。

4.浓度最高管（留少量电泳用，留0.5mL测[pr]），上已平衡好的DEAE-32

柱，0.02mol·L-1pH6.5NH4AC缓冲液洗脱。

5.用20%磺基水杨酸检测是否有蛋白流出，每管收集2mL。

6.收集的蛋白质溶液即为γ球蛋白。

电泳鉴定

1.安装垂直板型电泳装置。

2.配分离胶，加胶高度距样品槽模板下缘约0.5-1cm，水封，聚合30min，去

水（滤纸）。

3.配浓缩胶，加胶，插梳子，聚合15min。

4.去夹子，去胶条，连接电极槽，加电极缓冲液，拔梳子。

5.加样，将样品与样品处理液1:1混合后上样。

6.电泳，上槽接负极，下槽接正极，40mA/板。待指示剂迁移至下端0.5cm时，

停止电泳。

7.剥胶，于大培养皿。

8.染色，加入染色液使胶完全浸入，染色。

9.拍照

四、实验结果与分析

654321

注：1泳道为血清样，23泳道为脱盐样，456泳道为样品样。

结果分析：条带不整齐，可能是倒胶的时候没有到平。血清样和脱盐样各组

分分离结果不佳，可能是上样过多。样品样的条带不太清晰，说明其中的γ球蛋

白很少，可能在第二次分离中被稀释。

实验二等电聚焦电泳法测定蛋白质等电点

一、实验目的

1、掌握等电聚焦电泳法的基本原理。

2、巩固圆盘电泳的基本操作。

3、学习用该方法测定蛋白质的等电点。

二、实验原理

首先应用电流在凝胶溶液中建立稳定的PH梯度，然后添加蛋白样品，利用

电场，蛋白质移动到特定的等电点(PI)，同样等电点的蛋白质可以通过凝胶电泳

进行进一步的分离。

三、实验方法

1、取凝胶管2根。

2、置于胶凝胶管架。

3、配胶，加胶。

4、聚合20-25分钟，至界面再次出现。

5、去水，置于圆盘电泳槽中。

6、封住多余空穴。

7、电泳，在下槽中装入2％氢氧化钠溶液。避免管下有气泡。在上槽中加入5％

磷酸缓冲液，去除管上气泡。上槽接电泳仪的正极，下槽接负极，打开电源，稳

压160V电泳至电流无限接近于0，关闭电源。

8、剥胶，电泳结束后取下凝胶管，用清水将两端电极液洗净，在凝胶的正端插

入毛细管，作为标记。

9、1根胶条：量长度，置10％TCA中固定；1根胶条：从正极端开始，每隔0.5

cm切割，依次放入盛有１mlDW的试管中浸泡。

10、测定

固定胶条：固定后长度，蛋白质沉淀线距正极端距离

切割胶条：测各管pH值。

11、PH梯度的制作

12、蛋白质样品等电点的制作。

五、实验结果

1、求出蛋白质聚焦部位距凝胶条正极端的实际长度为：

固定前凝胶条的长度

固定后的蛋白质区带中心距凝胶条正极端的距离×固定后凝胶条的长度

=3.5×9.5/8.6=