DB15T 3438-2024 产气荚膜梭菌分离与鉴定操作规程.docxVIP

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内蒙古自治区地方标准

DB15/T3438—2024

产气荚膜梭菌分离与鉴定操作规程

Operatingproceduresforisolationandidentificationofsheepclostridiumperfringens

2024-05-31发布2024-07-01实施

内蒙古自治区市场监督管理局发布

DB15/T3438—2024

I

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

本文件由内蒙古畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC19）归口。

本文件起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院。

本文件主要起草人：白帆、戴伶俐、赵启南、王娜、张月梅、孟子琪、杨磊、李慧、张帆、宋越、刘威、杨斌、刘敏、罗晓平、李军燕、高娃、达来宝力格、赵世华。

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产气荚膜梭菌分离与鉴定操作规程

1范围

本文件规定了羊产气荚膜梭菌分离与鉴定操作方法。本文件适用于实验室进行产气荚膜梭菌的分离鉴定。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB4789.28食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

产气荚膜梭菌clostridiumperfringens（C.perfringens）

旧称魏氏梭菌（C.welchii），梭菌科梭菌属微生物，菌体直杆状，两端钝圆，单在或成双，革兰阳

性，无鞭毛，有荚膜，一般条件下罕见形成芽孢，芽孢卵圆形，位于菌体中央或近端。依据所产生的主要致死毒素，可将本菌分为A、B、C、D、E、F和G七个毒素型。

4操作步骤

方法概要

检测程序的流程示意图按照附录A要求。

培养基和试剂

4.2.1除另有规定，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682的超纯水。

4.2.2胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸（TSC）琼脂平板：见附录B中B.1。

4.2.3液体硫乙醇酸盐培养基（FTG）：见附录B中B.2。

4.2.4含铁牛奶培养基：见附录B中B.3。

4.2.5乳糖亚硫酸盐培养基(LS)：见附录B中B.4。

4.2.6TaqDNA聚合酶

4.2.7琼脂糖：电泳级

4.2.8溴化乙锭

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4.2.9分子量标记：DL-600、DL-2000

4.2.10TAE缓冲液

10mmol/LTris-HCl（pH8.0），1mmol/LEDTA（pH8.0）。

仪器和设备

4.3.1旋涡振荡器。

4.3.2天平：称量范围0g～500g，读数精准度0.01g。

4.3.3核酸电泳仪。

4.3.4PCR仪。

4.3.5凝胶成像系统。

4.3.6恒温培养箱：37℃。

4.3.7恒温水浴锅：46℃。

4.3.8高压蒸汽灭菌锅。

4.3.9厌氧培养箱。

4.3.10光学显微镜。

4.3.11低温离心机：2℃~8℃。

4.3.12冰箱：2℃~8℃。

方法

4.4.1样品采集

对活羊可采集直肠内粪便或肛拭子，粪便样品应选新鲜粪便至少10.0g，使用无菌容器运送，肛拭子样品应取无菌棉拭子插入肛门中，旋转2～3圈，充分刮取直肠黏液或粪便；新近病死或剖杀羊只无菌采集肝脏、肾脏、脾脏、心脏、淋巴结或肠道内容物。样品4℃下保存和运输，24h内送检。

4.4.2细菌的分离

4.4.2.1组织样本的分菌

用经火焰灭菌并冷却的接种环蘸取病料内部组织后划线接种于TSC琼脂平板，倒置于厌氧培养箱内，于37℃培养20h～24h后观察菌落形态。

4.4.2.2肛拭子、粪便或肠道内容物样本的分菌

将棉拭子样品置于20mL无菌生理盐水中旋涡混匀30s，静置1min；称取1.0g～5.0g粪便或肠道内容物样品，置于装有20mL无菌生理盐水的50mL离心管中旋涡混匀30s，静置1min。吸取50μL上层液体，均匀涂布在TSC琼脂平板上。倒置于厌氧培养箱内，于37℃培养20h～