ELISA实验详细流程及溶剂配置参考.pdfVIP

ELISA-Zhaoke

1溶液配制

1.1PBS：磷酸盐缓冲呀（10X）

配制1L

成分数量（g）

NaCl80g

NaHPO•12HO32.3g

242

NaHPO•2HO4.5g

242

加入双蒸水900ml左右，调节PH7.4，定容至1000ml。

1.2PBST：磷酸盐吐温缓冲液

Tween-20为一种非离子表面活性剂，一种去污剂，能够在不破坏蛋白质的情况下，洗脱非特异性结合的抗

体。Tween-20既含亲水基团，也含疏水基团，其在洗涤中的作用机理是：借助其疏水基团与经疏水性相互

作用被动吸附于聚苯乙烯固相上蛋白的疏水基团形成疏水键，从而削弱蛋白与固相的吸附，同时在其亲水

基团与液相中水分子的结合作用下，促使蛋白质脱离固相而进入液相，这样就可达到去掉非特异吸附物的

目的。

洗涤缓冲液：含0.05%Tween-20的中性PBS（即1*PBST）

配置：100ml10*PBS;2.5ml20%Tween-20，定容至1L

调节PH7.4

1.320%Tween-20

10gTween-20,加蒸馏水约30ml,可4℃过夜，溶解均匀后定容至50ml。

1.4包被缓冲液

0.05mol/L碳酸缓冲液（PH9.6）

配制：

碳酸钠0.75g，碳酸氢钠1.46g，定容至500ml，测PH9.6.

1.5封闭液

要求：用4℃预冷的1*PBST配置成2%的BSA溶液

配制：10ml2%BSA封闭液：0.2gBSA粉末，溶解于10mlPBST中，摇晃溶解，后放入4℃

冰箱（最好提前一天配制，防止泡沫过多）。

保存：4℃

1.6Tris稀释液

1.7血样稀释液

ELISA-Zhaoke

A.小肽标签稀释液母液：60mg/ml（-80℃保存）

配制：1ml60ug/ml的小肽：1ml4℃2%BSA1*PBST+1ul小肽母液，混匀，4℃保存

B.血清稀释液

血清稀释液：5ug/ml（溶质是小肽，溶剂是封闭液）

一块96孔板需要12ml血清稀释液，即11ml的封闭液，1ml60ug/ml的小肽

1.8显色液

TMB，是辣根过氧化物酶的常用底物。

在辣根过氧化物酶或其他适当过氧化物酶的催化下，TMB会产生蓝色产物。蓝色产物在

370nm/620-650nm测定吸光度（A）

1.9终止液

2MHSO一次性滴管吸取，慢慢加入水中。(M=mol/L)

24

配制：

180mlHO：20mlHSO=9:1（浓硫酸加入水中，并搅拌散热）

224

2实验流程

2.1PDA铺板

DA母液：

一级母液：

二级母液：80ug/ml（溶剂是蒸馏水）

梯度稀释：（溶剂是pH：8.8tris）

4ug/ml2ug/ml1ug/ml0.5ug/ml0.25ug/ml0.125ug/ml0.063ug/ml

1.按照梯度稀释表进行倍比稀释。

2.（铺板条件）按100ul/孔加至96孔酶标板凹孔里，常温（25℃）过夜。

2.2洗涤

1.铺板结束后弃掉铺板液，用蒸馏水清洗3次。

2.最后拍干净96孔酶标板。

2.3包被

取出