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感受态细胞的制备
—LB液体培养基:胰蛋白胨,1%(W/V);酵母提取物,0.5%(W/V);NaCl,
1%(W/V),用固体NaOH调节pH为7.0~7.2,分装于三角瓶中,灭菌后存于
室温。摇动三角瓶,如果发现变浑浊,表明已染菌,应弃掉重新配制;
—0.1mol/LCaCl:称取1.47gCaCl•2H0(Amresco分装)溶于100mL去离子
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水中,灭菌后存于4℃;
—离心管(50mL或80mL或100mL),灭菌;
—培养试管,灭菌;
—1mL枪头,灭菌;
—1mL加样枪;
—滤纸,用牛皮纸包好后灭菌;
—10mL量筒,灭菌;
—5mL移液管,用棉花塞入管口,卷于报纸中灭菌;
—冰,离心管架;
—恒温摇床,可见分光光度计,玻璃比色杯。
1.接种空白大肠杆菌于3mLLB培养基中,37℃剧烈震荡培养过夜;
2.将已培养好的种子液转入100mLLB培养基中扩大培养至OD=0.3后,将
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培养好的细菌置于冰上冷却10min;
3.4℃,4000rpm离心10min收集细菌,倒出上清,将离心管倒置于一干净滤
纸上,将培养基控干;
4.用40mL冰预冷的CaCl悬浮细菌,用加样枪冲吸,使菌体尽可能分散。冰
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上放置30min;
5.4℃,4000rpm离心10min收集细菌,倒出上清,再用4mL冰预冷的CaCl2
悬浮细菌,这些细菌可以立即使用,或者于4℃放置12~24h以增加其敏感性
后使用。
6.如果证明所制备的感受态细胞可用,可以在冰上分装为100μL每管,再加入
100μL甘油(注意:甘油非常黏稠,吸取时应该多一点。),于液氮或-70℃冰
箱中存放。存于低温下的感受态细胞,一定不能融解。如果已经融解,应丢弃,
而不能再冻结保存而继续使用。
注意事项:
1.本实验室所用空白大肠杆菌菌株为JM109。空白菌可以于平板上划线后,用
Parafilm包好后存于4℃,也可将液体培养物存于4℃。但如果要长期保存,
则应将细菌保存于50%的甘油中,存于-20℃或-70℃。当接种的细菌是来自于
-20℃或-70℃存放的液体培养物时,接种应迅速,不等解冻,立即从表面刮下
一块冰后,将菌种迅速放回低温存放;
2.一般于3mLLB培养基中过夜培养12h后,菌体已很浓,可以进行扩大培养。
于100mL培养基中培养2~3h后,即可达到对数生长期。但有时如果由于存
放过久,或者已经过数次解冻,造成细菌生活力下降,则倍增时间会延长;
3.对OD值的监测,当肉眼看到菌体已很浓时,于超净台上取3mL测OD值。
开始可以每30分钟检测一次,越到后面检测的时间就应该缩短;
4.感受态细胞的制备应该再严格无菌的条件下进行。因此,所有操作均应在超
净台上。也可以在实验台上进行,但应在后面放一酒精灯,所有操作都不能远
离火焰。最好每次恰好做感受态之前,将所有的枪头和管子都灭一下菌,用酒
精棉球将加样枪的前端擦拭一遍;
5.感受态细胞的细胞膜比较脆弱,因此一当用冰冷的CaCl悬浮以后,即不能
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剧烈震荡或快速抽吸;
6.根据我们的经验,纯度较高的含结晶水的CaCl可以得到好的实验结果;
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7.所有的枪头和管子均应干净。如果有可能,都尽量用新的。如果是用的回收
的枪头,一定要看管壁是否干净。
8.扩大培养用的液体培养基体积可以调整。调整后的CaCl溶液体积也按比例
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