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生物指示剂耐受性检查法指导原则（新增）

第一次征求意见稿

生物指示剂的耐受性是指其所含的微生物能够耐受各种灭菌程序的能力。一般来说，生物

指示剂的耐受性用D值来表示。D值是指将生物指示剂中的微生物

杀灭90%所需的灭菌时间或灭菌剂量。生物指示剂的主要质量参数包括总芽胞数、D值

和存活时间、杀灭时间。

本指导原则用于指导生物指示剂的耐受性以及相关质量参数的测定，也可用于生产过程污

染微生物的耐受性测定。

总芽胞计数

培养基

芽胞计数可用胰酪大豆胨琼脂培养基或其它适宜的培养基。姨酪大豆胨琼脂培养基照无菌

检查法（通则1101）制备，其它培养基照生物指示剂使用说明书进行制备。芽胞计数用

培养基应进行培养基适用性检查。

稀释液

灭菌纯化水（或其他经过验证的无菌溶液）

芽胞悬液制备

芽胞悬液制备方法如下，如果下列方法经确认不适用，应建立其他适宜的方法。

根据生物指示剂的载体和初级包装情况，采取适宜的制备方法将载体上的细菌芽胞充分洗

脱并混悬于稀释液中。

1）液体芽胞悬液生物指示剂

将芽胞悬液生物指示剂样品充分混匀后，或经过超声处理后，取1ml，用稀释液制成

1:10的供试液。

2）纸质载体生物指示剂或自含式生物指示剂

取不少于3个最小单位生物指示剂，将纸片载体从初级包装中取出，置适量的稀释液中，

采用搅拌、涡旋或其它适当的方式，使容器里的纸片成纤维状（建议至少需要15分钟的

浸泡和搅拌以使芽胞能充分回收），充分混合制成均一的混悬液。

3）非纸质载体的生物指示剂

取不少于3个最小单位的生物指示剂，将载体从初级包装中取出，置适量的稀释液中，可

采用超声波(振荡器)反复振摇，或其他适宜的方法将载体上的芽胞充分分散于稀释液中。

热激活

取上述制备的芽胞悬液10ml，置灭菌试管中，按照表1的要求进行热激活处理，时间达

到后将芽胞悬液转移至0～4℃的冰水浴中迅速冷却至室温。

培养和计数

取上述经热激活的芽胞悬液，用灭菌纯化水进行10倍系列稀释，取芽胞数在30～300

cfu/皿稀释级的芽胞悬液1ml，置直径90mm的无菌平皿中,注入15～

20ml温度不超过45℃熔化的胰酪大豆胨琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养，

按照表1的推荐的培养温度和培养时间培养。每稀释级每种培养基至少制备2

个平板。逐日点计和记录各平板的菌落数，并计算每个最小单位生物指示剂的平均芽胞

数。

生物指示剂的总芽胞数一般为标示值的50%～300%。

表1生物指示剂的芽胞计数的试验条件

D值测定

仪器

湿热灭菌用生物指示剂的D值测定，可采用两种设备实现灭菌条件，一种是抗力仪（能

够实现短时升温和降温的灭菌器），该设备适用于纸片式、自含式、芽胞悬液形式等的生

物指示剂。另一种是油浴仪（能够设定到100℃以上的恒温设备），该设备适用于芽胞悬

液生物指示剂。为保证测定结果的准确性，抗力仪的各项参数应满足GB/T24628的要

求。

测定方法

生物指示剂的D值测定可采用阴性分数法（LHSKP法，也叫部分阴性法）或

残存曲线法，测定方法参见GB18281.1（医疗保健产品灭菌生物指示物第1部分：通

则）。

阴性分数法

取不少于5组生物指示剂，每组数量相同（一般不少于20支），将每组生物指示剂暴

露于特定灭菌条件下，各组对应的灭菌时间（剂量）递增，其余灭菌工艺参数应保持一

致。相邻2组灭菌时间（剂量）间隔相同，且不大于标示D值的75%。在不少于5组

的生物指示剂中，至少1组在灭菌后培养各支均呈阳性，2组在灭菌后培养部分呈阴性

部分呈阳性，2组在灭菌后培养各支均呈阴性，详见表2。生物指示剂灭菌后培养条件应

与产品使用说明中的培养条件一

致。根据各组的阴性与阳性结果来计算D值。

表2相同时间间隔和相同样品数量的LHSKP法计算所需的数据示例

计算公式：

残存曲线法

取不少于5组生物指示