他克莫司在治疗重型再生障碍性贫血中的免疫调节作用.docx

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他克莫司在治疗重型再生障碍性贫血中的免疫调节作用

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山东省青岛市中国人民解放军海军第971医院266000

摘要：目的探讨重型再生障碍性贫血（SAA）患者应用他克莫司治疗的临床效果。方法选取2020年1月~2021年4月我院收治的18例SAA患者作为观察对象，在患者的骨髓CD8＋HLA-DR＋T细胞中加入白细胞介素2（IL-2）与他克莫司，培养72h后，通过光密度法检测培养孔的细胞增殖，然后分离患者的骨髓T淋巴细胞，并加入IL-2、环孢素（CsA）与他克莫司。另设置不加入任何刺激因子的对照组（IL-2浓度为U/mL），培养18h后加入佛波酯，活化4h。评价细胞增殖检测结果。结果IL-2浓度为20U/mL、200U/mL、2000U/mL时，细胞增殖明显，与对照组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05），加入他克莫司后，可有效抑制以上三种浓度IL-2对细胞的增殖作用，差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论IL-2对SAA患者的CD8＋HLA-DR＋T细胞增殖具有促进作用，他克莫司可以有效抑制这种增殖作用。

关键词：重型再生障碍性贫血；他克莫司；免疫调节；作用

SAA指的是在生物、化学、物理等因素的影响下，骨髓干细胞或者（和）骨髓祖细胞与造血微环境遭到破坏，从而引起造血功能障碍、骨髓造血容量减少等症状，最终出现以非造血成分（脂肪细胞）为临床特点的一种全血细胞减少综合征[1]。SAA具有发病急、病情发展快等特点，严重威胁患者的生命。随着医疗科技的发展，免疫抑制剂治疗与基因造血干细胞移植已经可以让SAA患者获得较为理想的预后，但除此治疗的失败率仍在30%以上[2]，而且治疗后患者的复发率较高。如何弥补治疗失败这一问题，是目前临床研究的重点和难点。本文以2020年1月~2021年4月我院收治的18例SAA患者为例，探讨了他克莫司的免疫调节作用，现报告如下。

1资料与方法

1.1一般资料

入组的18例SAA患者，全部符合《血液病诊断及疗效标准》[3]中的诊断标准：①骨髓中有核细胞的数量低于正常值25%，或者骨髓中的有核细胞数量占正常值的25%~30%，但剩余的造血干细胞＜30%。②满足以下三项中的≥2项标准：血小板数＜20×109/L、中性粒细胞绝对值＜0.5×109/L、网织红细胞＜20×109/L。患者中男性8例、女性10例；年龄最小20岁、最大74岁，平均年龄（46.92±2.37）岁。所有患者均选自2020年1月~2021年4月，自愿签署知情同意书。

1.2方法

①细胞分选：采集患者的骨髓标本20mL，放置在含有肝素的试管中，用磷酸盐缓冲液（PBS）进行两倍稀释，用比重为1.077的淋巴细胞分离液，采用密度梯度法对单个核细胞进行分离，分离半径为13.5cm。每1×107个细胞中加入20μL的CD8抗体，在4℃环境下孵育15min，洗涤两次。磁性过柱后脱离磁场，彻底清洗柱子，收集细胞。再次加入20μLCD8解离抗体来解离细胞，5min停止抗体中断解离后，再加入20μL的HLA-DR抗体，孵育温度与时间同上，洗涤两次，按上述方法收集细胞。使用流式细胞仪检测分选细胞的纯度，将细胞1×105、PE-CD8、FITC-HLA-DR各10μL加入试管内。对照组同样加入以上分选所得的细胞1×105与同型对照各10μL。在4℃下遮光孵育20min，PBS洗涤两次后上机。

②细胞增殖检测方法：在96孔板中接种以上分选细胞，密度2×105。IL-2组、他克莫司组分别接种6孔、7孔，每个孔均为含有12%胎牛血清的RPMI1640培养基。设置培养箱温度37℃、饱和度湿度以及5%二氧化碳。24h后，将终浓度为0、0.2、2、20、200、2000U/mL等六种浓度的IL-2加入IL-2组，将终浓度为100ng/mL的他克莫司在以上IL-2浓度梯度的基础上加入他克莫司组的各孔。培养48h后，在各个孔内加入20μL四甲基偶氮唑盐（MTT），继续培养4h，以2500r/min的速率离心分离，分离半径为13.5cm，取培养液。将150μL的二甲基亚砜加入各孔，10min后，通过酶联免疫吸附法检测各孔的吸光度（A490nm）值。

1.3统计学方法

本研究应用SPSS19.0统计学软件进行处理，计量资料以（`x±s）表示，组间比较采用t检验，计数资料以率（%）表示，组间比较进行x2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

细胞增殖检测结果：IL-2浓度越高，IL-2组细胞的增殖就越明显，细胞增殖最明显的IL-2浓度为20U/mL、200U/mL、2000U/mL，均显著高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。以上各浓度的IL-2对细胞的增殖作用，都