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反义核酸技术一、RNAi基本概念及相关作用机制二、siRNA序列设计及制备；脱靶效应三、siRNA转染过程相关问题RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是双链RNA特异性地结合到与之序列互补的mRNA上，导致mRNA降解，从而介导转录水平基因表达抑制。一、RNAi基本概念及相关作用机制二、siRNA序列设计及制备；脱靶效应三、siRNA转染过程相关问题siRNA序列设计注意事项1、化学合成法2、体外转录法3、Dicer/RNaseⅢ酶解1、多设计几条siRNA序列，以筛选最特异、最有效的siRNA序列2、阴性对照3、阳性对照4、siRNA荧光标记siRNA制备方法脱靶效应定义：影响因素检测方法：如何尽量避免？指siRNA转染中的非特异反应，这不仅包括siRNA序列，还包括转染试剂本身或其他相关因素对转染细胞的其他相关基因发生非特异性的表达变化，从而导致假阳性和假阴性。基因表达谱芯片siRNA浓度转染试剂2、采用不同转染试剂进行实验1、针对同一靶基因设计2条以上抑制效率在70％以上的不同siRNA序列，分别进行实验一、RNAi基本概念及相关作用机制二、siRNA序列设计及制备；脱靶效应三、siRNA转染过程相关问题siRNA转染方法：转染试剂脂质体类非脂质体聚合物类lipofectamineTM2000和RNAiMAXEntransterTM转染过程相关问题1、细胞数量2、siRNA浓度3、血清4、抗生素5、转染后换液6、转染条件优化7、RNAi检测方法化学方法，电转化系列(EntransterTM-R)siRNALipofectamine?RNAiMAXReagentDiluteLipofectamine?RNAiMAXReagentinOpti-MEM?mediumDilutesiRNAinOpti-MEM?mediumAddDilutedsiRNAtoDilutedLipofectamine?RNAiMAXReagent(1:1ratio)cellsAddsiRNA-reagentcomplextocells
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