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琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制

[原理]

肌肉组织中含有琥珀酸脱氢酶，能催化琥珀酸脱氢转变成延胡索酸。反应中生成的FADH2可使蓝色的甲烯蓝还原为无色的甲烯白(还原型甲烯蓝)。丙二酸与琥珀酸的分子结构相似，是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂，故能与琥珀酸竞争琥珀酸脱氢酶的活性中心。丙二酸与琥珀酸脱氢酶结合后，酶活性受到抑制，则不能再催化琥珀酸的脱氢反应。抑制程度的大小，随抑制剂与底物两者浓度的比例而定。

本实验以甲烯蓝为受氢体，在隔绝空气的条件下，通过甲烯蓝的褪色程度来判断琥珀酸脱氢酶的活性，并籍此观察丙二酸对琥珀酸脱氢酶活性的抑制作用。

CH2COOH

CH2COOHFADMB?2H（甲烯白）

琥珀酸

琥珀酸脱氢酶

琥珀酸脱氢酶

CHCOOH

HOOCCHFADH2MB（甲烯蓝）

延胡索酸

[试剂]

1．0.2mol/L琥珀酸:取琥珀酸钠(MW:270.14)27克加水至500ml。

2．0.02mol/L琥珀酸:取1液稀释10倍。

3．0.2mol/L丙二酸:取丙二酸钠(MW:166.05)16.7克加水至500ml。

4．0.02mol/L丙二酸:取3液稀释10倍。

5．1/15mol/LpH7.4磷酸盐缓冲:1/15mol/LNa2HPO4溶液80.8ml与1/15mol/LKH2PO419.2ml混合即成。

（1）1/15mol/LNa2HPO4溶液:取Na2HPO4.12H2O（MW：358.14）23.876克,加水至1000ml。

（2）1/15mol/LKH2PO4溶液:取KH2PO4（MW：136.09）1.814克,加水至200ml.

6．0.02％甲烯蓝溶液

7．液体石蜡

[主要器材]

1．新鲜猪心

2．玻璃研钵

3．漏斗

4．手术剪

5．棉花

6．恒温水浴箱

[操作步骤]

心肌提取液的制备取新鲜猪心约6g，用蒸馏水清洗后剪成碎块，置于研钵中，加入适量净沙，研磨成糜状。再加1/15mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液12ml，研成糊状，用棉花过滤，滤液即为猪心提取液。

取小试管5支，编号，按表11操作：

表11

试剂（滴）1管2管3管4管5管

猪心提取液20202020─

0.2mol/L琥珀酸444─4

0.02mol/L琥珀酸───4─

0.2mol/L丙二酸─4─4─

0.02mol/L丙二酸──4──

蒸馏水4───24

0.02％甲烯蓝11111

3．将上述各管摇匀,于各管滴加液体石蜡5滴以隔绝空气，置于37℃水浴中保温，随时观察各管甲烯蓝褪色情况，记录时间，确定5个试管的褪色顺序并解释结果。

[注意事项]

1.加液体石蜡时宜斜执试管，沿管壁缓缓加入，不要产生气泡。

2.加完液体石蜡后，在观察结果的过程中，不要振摇试管,以防止溶液与空气接触而使甲烯蓝重新氧化变蓝。