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CRISPR/Cas9基因敲除技术

CRISPR/Cas9（ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats）是一种由RNA

指导的Cas9核酸酶对靶向基因进行编辑的技术。

CRISPR/Cas9是细菌和古细菌为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的获得性免疫防御

目前，

机制。来自Streptococcuspyogenes的CRISPR-Cas9系统应用最为广泛。在这一系

统中，crRNA（CRISPR-derivedRNA）通过碱基配对与转录激活crRNA（trans-activatingRNA，

，

tracrRNA）退火结合形成双链RNA能特异性识别基因组序列Cas9蛋白（含有两个核酸

酶结构域，可以分别切割DNA两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物，

然后通过PAM序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链

进行切割，生成DNA双链断裂（double-strandbreaks,DSBs）。在基因组编辑过程中，tracrRNA

和crRNA可以融合成为1条RNA（sgRNA）表达同样可以起到靶向剪切的作用。

通过基因工程手段对crRNA和tracrRNA进行改造，将其连接在一起得到sgRNA

（singleguideRNA）。融合的RNA具有与野生型RNA类似的活力，但因为结构得到了简

化更方便研究者使用。通过将表达sgRNA的原件与表达Cas9的原件相连接，得到可以同时

表达两者的质粒，将其转染细胞，便能够对目的基因进行操作。

由于PAM序列结构简单（5’-NGG-3’），几乎可以在所有的基因中找到大量靶点，

因此得到广泛的应用。

与锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活样效应核酸酶（Transcriptionactivator-likeeffector

nucleases,TALEN）相比较，CRISPR-Cas系统介导的基因组靶向实验在真核细胞中具有相

似甚至更高的效率。

CRISPR/Cas9系统可广泛应用于基因组工程，如基因抑制，基因敲除，基因敲入，基

因修复等。CRISPR-Cas9体系的RNA-DNA识别机制为基因组工程研究提供了一项简便而

强大的工具。其最重要的优势是Cas9蛋白可在多个不同的gRNA的引导下同时靶向多个基

因组位点，起到多靶点调控的作用。

起源：

1、2007年，来自丹尼斯克公司（一家总部位于丹麦哥本哈根的食品添加剂公司，目前

被杜邦公司收购）的科学家找到了一种能增强细菌防御噬菌体能力的方法。

2、2013年，四个研究团队报告了这一被称为CRISPR的系统，自此CRISPR技术红红

火火的发展了起来，许多科研团队利用它来删除、添加、激活或抑制人体、老鼠、斑马鱼、

细菌、果蝇、酵母、线虫和农作物细胞中的目标基因。

3、2015年，蒙大拿州立大学的两位学者以―CRISPR-RNA-GuidedAdaptiveImmune

Systems‖为题，介绍了CRISPR-Cas免疫应答系统。

其中BlakeWiedenheft就是当年加州大学伯克利分校JenniferDoudna研究组成员，他们

曾于2010年破解了Csy4核糖核酸内切酶原子水平的晶体结构模型——研究人员确定Csy4

是一种存在于原核细胞的酶，它能够启动生成CRISPR衍生RNAs(crRNAs)，这种小RNA

分子能够靶向并沉默侵入的病毒和质粒。

CRISPR与RNAi的区别

目前已经广泛应用的RNAi技术的靶标是mRNA，而CRISPR通过RNA