利用FPLC分析转基因小型猪血浆脂蛋白1.docx

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利用FPLC分析转基因小型猪血浆脂蛋白

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摘要：为了分析ApoCIII转基因小型猪中脂蛋白组成的变化，本文应用快速蛋白液相色谱（FPLC）法对转基因小型猪脂蛋白组成的变化进行表征，分别检测转基因猪的肝脏和小肠的ApoCIII，转基因小型猪的VLDL颗粒明显高于非转基因小型猪。结果表明，转基因小型猪过表达了人的ApoCIII。

关键词：ApoCIII；转基因小型猪；VLDL

AnalysisoftransgenicminiaturepigplasmalipoproteinbyFPLCsystem

JINGWeiWEIJing-yuan

(LiaoningProvinceAcademyofAnalyticSciences,Shenyang110015)

ABSTRACT:ToanalysisthechangesinlipoproteincompositionofApoCIIItransgenicminiaturepig,Fastproteinliquidchromatography(FPLC)wereperformedtocharacterizethechangesoflipoproteincompositioninthetransgenicminiaturepig.Asaresult,hApoCIIIweredetectedinthetransgenicminiaturepig’sliverandsmallintestine,andthetransgenicminiaturepig’sVLDLparticlesissignificantlyhigherthannontransgenicminiaturepig.TheresultsshowedthatVLDLparticlessignificantlyincreasedbecauseofoverexpressionofhApoCintransgenicminiaturepig.

Keywords:apolipoproteinCIII；transgenicminiaturepig；VLDL

载脂蛋白CⅢ(ApolipoproteinCⅢ，ApoCⅢ)是一种低分子水溶性蛋白质，79个氨基酸残基，单链多肽，分子量为8.7-8.8kD，主要分布在血浆高密度脂蛋白（highdensitylipoprotein，HDL）、极低密度脂蛋白（verylow-densitylipoprotein，VLDL）和乳糜微粒（chylomicron;，CM）中。ApoCⅢ抑制脂蛋白脂酶（lipoproteinlipase，LPL）[1，2，3，4]，但没有证据显示他们之间存在直接结合[5]。我们应用核移植［6］等技术，获得了人ApoCⅢ（hApoCⅢ）转基因克隆小型猪[7]。hApoCⅢ转基因克隆猪由于过表达了人的ApoCⅢ蛋白，其脂蛋白构成发生了变化，由此也带来了一些生理功能方面的改变，本文对此进行了分析和探讨。

FPLC全称为快速蛋白液相色谱(Fastproteinliquidchromatography),其原理与高效液相色谱理论类似，利用不同的层析柱(疏水、离子交换、凝胶、亲和、反相等),将所需的蛋白质[8，9]、多肽[10]及多核苷酸[11]或要去除的杂蛋白从样品中分离出来。

FPLC不但保持了HPLC的快速、高分辨率等特性,而且还具有柱容量大、回收效率高及不易使生物大分子失活等特性；因此在近年来在分离蛋白质、多肽及寡核苷酸等方面得到了广泛应用。

1材料

1.1实验动物

hApoCⅢ转基因克隆猪。

1.2仪器和材料

快速蛋白液相色谱仪（AKTAexplore10），Superdex200TM10/30GL型凝胶过滤柱，Milli-Q纯水机，0.22μmMillipore滤膜。离心机（CF16RXII,日立）。

乙腈为色谱纯，其他为分析纯。

流动相：乙腈-水体积比1︰1，流速为1.0mL/min。检测波长为360nm，柱温25℃，进样量为20μL。

2方法

2.1FPLC(快速蛋白液相色谱)分析

小型猪血浆200μl，0.22μm滤器过滤后上样,以500μl/min的速度自动收集所分离的组份,每个组份500μl,共收集35个组份。

2.2VLDL的SDS

分别采集转基因和非转基因小型猪血浆各5ml，缓慢加至含有5ml生理盐水的10ml离