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双抗体夹心法--第1页

1.双抗体夹心法

双抗体夹心法，属于非竞争结合测定。它是检测抗原最常用的

ELISA，适用于检测分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原，而

不能用于小分子半抗原的检测。

其基本工作原理是：利用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体分

别与样品中被检测抗原分子上两个抗原决定簇结合，形成固相抗体-

抗原-酶标抗体免疫复合物。由于反应系统中固相抗体和酶标抗体的

量相对于待测抗原是过量的,因此复合物的形成量与待测抗原的含量

成正比(在方法可检测范围内)。测定复合物中的酶作用于加入的底物

后生成的有色物质量(OD值)，即可确定待测抗原含量。若固相载体

上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个不同的抗

原决定簇结合，则属于双位点夹心法。若采用固相载体上的抗原和酶

标抗原分别与样品中被检测抗体分子结合，则是双抗原夹心法。

操作步骤：

⑴将特异性抗体包被固相载体McAb。孵育一定时间，使形成固相

抗体，洗涤除去未结合的抗体和杂质。

⑵加待检标本，孵育，使标本中的抗原与固相载体上的抗体充分

反应，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。

⑶加酶标抗体，孵育，使形成固相抗体-待测抗原-酶标抗体夹心

复合物。洗涤除去未结合酶标抗体。

⑷加底物显色。固相上的酶催化底物产生有色产物,通过比色,测

标本中抗原的量。

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现多采用针对单一抗原决定簇特异性的单克隆抗体做固相化和

酶标抗体，则受检样品和酶标抗体可一次性加入，简化流程，缩短反

应时间。若标本中待测抗原浓度过高，抗原可分别与酶标抗体和固相

抗体结合而不形成上述夹心复合物(类似于免疫沉淀反应中抗原过剩

时的后带现象)，使最终结果低于实际含量(钩状效应)，甚至出现假

阴性现象。因此对此类标本应适当稀释后再测定。另外，当血清中存

在类风湿因子（RF）时，类风湿因子（RF）可充当抗原，而形成固相

抗体-类风湿因子-酶标抗体夹心复合物，从而出现假阳性结果。

2.间接法

此法是测定抗体最常用的方法,属非竞争结合试验。其原理是将

抗原连接到固相载体上，样品中待测抗体与之结合成固相抗原-受检

抗体复合物，再用酶标二抗(针对受检抗体的抗体，如羊抗人IgG抗

体)与固相免疫复合物中的抗体结合，形成固相抗原-受检抗体-酶标

二抗复合物，测定加底物后的显色程度，确定待测抗体含量。

操作步骤

⑴将已知抗原包被固相载体,形成固相抗原。洗涤除去未结合的

抗原及杂质。

⑵封闭:用高浓度无关蛋白封闭,阻止待检血清中非特异IgG吸

附固相。

⑶加待检血清，孵育，使固相抗原和待检抗体充分结合，洗涤除

去未结合的非特异抗体及其他血清成分。

⑷加酶标抗体或酶标SPA，孵育，形成固相抗原-待检抗体-酶标

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抗抗体(或酶标SPA)复合物。

⑸加底物显色。

间接法由于采用的酶标二抗是针对一类免疫球蛋白分子(如抗人

IgG),因此该法只需要换固相抗原，即可用一种酶标二抗检测各种与

抗原相应的抗体，具有更广泛的通用性。

3.竞争法

竞争法ELISA可用于抗原和半抗原的定量测定，也