《甘蓝类蔬菜黑斑病菌分子检测技术规程》.docVIP

ICS65.020.20

B15

DB32

江苏省地方标准

DB32/T

甘蓝类蔬菜黑斑病菌分子检测技术规程

TechnicalregulationformoleculardetectionofAlternariabrassicicolaoncolecrops

（送审稿）

2024--发布2024--实施

江苏省市场监督管理局发布

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前言

本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

本标准的某些内容可能涉及专利。本标准发布机构不应承担识别这些专利的责任。

本标准由江苏省农业科学院提出并归口。

本标准起草单位：江苏省农业科学院、江苏省农业技术推广总站。

本标准主要起草人：余方伟、曾晓萍、李建斌、马金俊、王神云、张伟、于利。

甘蓝类蔬菜黑斑病菌分子检测技术规程

1范围

本文件规定了甘蓝类蔬菜黑斑病菌分子检测技术规程中重组酶聚合酶扩增方法的原理、试剂和材料、仪器设备、试验步骤和结果判定。

本文件适用于甘蓝类蔬菜叶片、花茎、角果等样品中芸薹生链格孢（Alternariabrassicicola）的室内检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，标注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不标注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3甘蓝类蔬菜黑斑病菌基本信息

中文学名：芸薹生链格孢

英文学名：Alternariabrassicicola

分类地位：半知菌亚门，丝孢目，暗色菌科，链格孢属。

其菌落形态和孢子特征见附录A。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

DNA脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid）

RPA重组酶聚合酶扩增（Recombinasepolymeraseamplification）

ATP三磷酸腺苷（Adenosinetriphosphate）

5原理

重组酶聚合酶扩增是一种快速分子检测技术，主要依靠重组酶、单链结合蛋白和链置换DNA聚合酶在特定恒温条件下实现短时间内对靶标序列的高效扩增。RPA反应开始时，重组酶在ATP的参与下结合引物，形成重组酶-引物复合体。这些复合体能够扫描与引物序列互补的目标双链DNA，然后侵入5端位点，随后单链结合蛋白与被置换单链结合使其稳定。最后链置换DNA聚合酶结合在核酸蛋白复合体的游离3端，进行链延伸。以上步骤循环进行，实现DNA数量的指数增长。

6试剂和材料

除另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，实验室用水应符合GB/T6682的规定。

6.1.1RPA所用的引物序列见表1。

表1引物序列

引物

序列（5′→3′）

扩增片段大小

AbF1

CAGACATGAACACGCCAACATGACTAGACC

213bp

AbR1

GTGAGGCTTAGCGTAGAGTGTCAACGGTTC

6.1.2基因组DNA提取试剂盒。

6.1.3RPA试剂盒。

6.1.4DNA抽提液：Tris饱和酚、氯仿、异戊醇按体积比25:24:1混合。

6.1.550×TAE缓冲液。

6.1.6琼脂糖。

6.1.7核酸染料。

6.1.8DL2000DNAMarker。

7仪器设备

7.1电子天平，感量0.01g。

7.2台式低温高速离心机。

7.3微量移液器：最大量程分别为2.5μL、10μL、20μL、100μL和1000μL。

7.4PCR仪。

7.54℃冰箱和-20℃冰箱。

7.6水平电泳仪。

7.7凝胶成像仪。

8试验步骤

8.1样品采集

参照附录A信息，采集疑似黑斑病的病样，病样可暂时保存于4℃冰箱，但不宜超过48h。

8.2样品处理

取约100mg待检测样品置于液氮中充分研磨，使用基因组DNA提取试剂盒（CW0531M，江苏康为世纪生物科技股份有限公司）提取基因组DNA，保存于-20℃冰箱备用。

8.3RPA反应

以提取的疑似病株样品组织DNA溶液为模板，采用DNA恒温快速扩增试剂盒（WLB8201KIT，潍坊安普未来生物科技有限公司）进行RPA反应。同时设置以下对照：阳性对照为添加芸薹生链格孢基因组DNA溶液作为模板；阴性对照为添加健康甘蓝类蔬菜叶片来源的基因组DNA溶液作为模板；空白对照为添加无菌水作为模板。检测体系见表2。

表2芸