免疫细胞功能检测技术通用课件.pptVIP

免疫细胞功能检测技术

一淋巴细胞的功能检测淋巴细胞功能测定可分为体内实验和体外实验。体内实验主要是间接了解淋巴细胞对抗原、半抗原或有丝分裂原的应答反应；体外实验主要包括淋巴细胞对抗原或有丝分裂原刺激后的增殖反应、细胞毒性试验及淋巴细胞分泌产物的测定

淋巴细胞?T细胞（负责细胞免疫功能）?B细胞（执行体液免疫功能）?NK细胞（非特异性免疫作用）

一、T细胞功能的检测?T细胞增殖试验?T细胞分泌功能测定?T细胞介导的细胞毒试验?体内试验

（一）T淋巴细胞增殖试验1.原理：刺激物淋巴细胞DNA合成分化细胞变大细胞浆扩大空泡母细胞核仁明显核染色质疏松

未转化和转化淋巴细胞的形态特征转化的淋巴细胞未转化的淋巴细胞淋巴母细胞12～20过渡型12～16细胞大小(直径6～8μm)核大小、染色质核仁增大、疏松清晰、1～4个有或无增大、疏松有或无无不增大、密集无有丝分裂胞质、着色浆内空泡伪足无增多、嗜碱有或无增多、嗜碱有或无有或无极少、天青色无无有或无

2.淋巴细胞转化的刺激物非特异性刺激物：PHA------T细胞ConA-------T细胞PWM-------T、B细胞LPS-------B细胞特异性刺激物：异种抗原同种组织抗原

3.检测方法形态法：刺激物淋巴细胞（4-6天）母细胞化同位素法：PHA淋巴细胞（54h）DNA合成期+3HTdR掺入收集细胞检测β射线测定细胞内的3H－TdR

（1）形态学检查法

方法学评价：?优点：形态学方法简便易行，普通光学显微镜便能观察结果，适于基层实验室应用。?缺点：是依靠肉眼观察形态学变化，判断结果易受主观因素影响，重复性和准确性较差。

3H-TdR淋巴细胞测量放射性分层液

?优点：3H-TdR掺入法敏感性高，客观性强，重复性好。?缺点：但需一定设备条件，同时还存在放射性核素污染问题。

(3)MTT比色法MTT3H-TdR淋巴细胞测量测吸放光射性度分层液

(二)T细胞分泌功能测定体外培养的T细胞经各种丝裂原或抗原刺激后,分泌各种细胞因子,可借助免疫学、细胞生物学及分子生物学技术分别检测细胞因子含量、生物学活性或基因表达水平，以反映T细胞功能。

（三）T细胞介导的细胞毒试验1.原理：致敏CTLT细胞靶细胞抗原靶细胞观察杀伤活力

2.方法?形态学方法：淋巴细胞+肿瘤细胞计数残留肿瘤细胞意义：肿瘤患者CTL杀伤肿瘤细胞的能力

15-2T胞胞毒示意

51Cr释放法51Cr测量上清液中释放的51Cr去除游离的Cr51混合培养4-6小时

(四)体内试验?特异性抗原皮肤试验?PHA皮肤试验

二、B细胞功能检测?B细胞增殖能力的试验?溶血空斑试验?B细胞抗体形成功能的检测?体内试验

(一)B细胞增殖能力的试验抗IgM细菌脂多糖SAC的SPAB细胞增殖形态学H－TdR掺入法3

(二)溶血空斑试验1.原理：

2.方法学：?经典溶血空斑形成试验?被动溶血空斑试验

3．临床应用与评价?溶血空斑试验主要用于测定药物和手术等因素对体液免疫功能的影响?评价免疫治疗或免疫重建后机体产生抗体的能力。

(三)B细胞抗体形成功能的检测——酶联免疫斑点法ELISPOT1.原理：

2．应用与方法学评价：?该方法既可检测抗体分泌细胞，又可检测抗体分泌量。?优点：稳定、特异、抗原用量少；可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可定量；可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。

(四)体内试验?体内抗体产生的特异性抗原有白喉类毒素、破伤风类毒素、多价肺炎链球菌菌苗等。?将适量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫前及免疫后1周、2周、3周分别采血，分离血清，测定受检者免疫前后相应抗体的效价，判断受检者体内B细胞的功能。

三、NK细胞活性测定染色计数?形态法靶细胞溶解离心取上清测LDH或AKP?酶释法离心取沉淀测活细胞荧光?荧光法?同位素法?化学发光法测CPM值测发光强度常用靶细胞:K562细胞株

二吞噬细胞功能检测技术按其形态大小分为两类：大吞噬细胞—单核-吞噬细胞系统小吞噬细胞—中性粒细胞

一、中性粒细胞功能的检测?细胞趋化功能的检测?吞噬和杀菌功能的检测

(一)细胞运动功能——趋化功能检测1.原理：

2.方法：滤膜渗透法（Boyden小室法）琼脂糖平板法

(二)吞噬和杀菌功能测定1．显微镜检查法：

2.溶菌法

3．NBT还原试验NBT还原试验原理：N-NH2CN-N-C+H+N=NHN=N-R-甲臜（紫黑色）四氮唑基（淡黄色）

中性粒细胞NBT甲臜颗粒沉积于胞质中

二、巨噬细胞功能检测(一)炭粒廓清试验正常小鼠肝中枯否细胞可吞噬清除90%炭粒，脾巨噬细胞约吞噬清除10%炭粒。据此给小鼠定量静脉注射印度墨汁(炭粒悬液)，间隔一定时间反复取静脉血，测定血中炭粒的浓度，根据血流中炭粒被廓清的速度