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免疫荧光技术的几种实验方法及其分类

1、免疫标记法及其分类

1）荧光免疫法：

原理是应用一对单克隆抗体的夹心法。底物用磷酸-4-甲基伞形酮，检测产物发出的荧光，

荧光强度与Mb浓度呈正比，可在8min内得出结果。结果以Mb每小时释放的速率表示(△

Mb)表示。该法重复性好，线性范围宽，具有快速、敏感、准确的特点。

以双抗夹心法为例，首先将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体。除去未结合

抗体，然后加受检标本，使其中的蛋白抗原与固相抗体形成抗原抗体复合物。洗涤除去未结

合物，接着加入荧光标记的抗体，使之与抗原特异性结合，形成抗体—抗原—抗体复合物。

最后根据荧光强度，即可对蛋白抗原进行定量。

传统的荧光免疫法受本底荧光的干扰较大，时间分辨荧光免疫测定法是以具有特长寿

命的稀土金属如铕，作为标记物，加入正常液后激发测定，能有效去除短寿命本底荧光的干

扰。

2）放射免疫法

放射免疫法是以过量的未标记抗原与放射性物质标记的抗原，竞争性地与抗体结合，

形成有放射性的抗原—抗体复合物与无放射性的抗原—抗体复合物，并有过剩的标记抗原与

未标记的抗原。然后通过离心沉淀等方法，将抗原—抗体复合物与游离抗原分离，分别测定

其放射性强度与标准曲线比较，即可对未标记的待测抗原进行定量。

RIA法测定血清蛋白灵敏度高、特异性强，可准确定量到ng／ml水平。但早期的方法操作

麻烦，耗时长，且有放射性污染。近年来，随着单克隆抗体的应用，RIA的灵敏度又有了较

大提高，且操作大为简化，并已有商品试剂盒供应，使用方便。

3）酶联免疫法(ELISA)

ELISA法有竞争法和夹心法两种。竞争法是基于标准或血清Mb和微孑L板上包被的

Mb竞争性地与单克隆抗体相结合的原理而建立，该法的最低检测限为10μg／L，线性范围

达1000ug／L。夹心ELISA法与EIA具有良好的相关性(r＝0.92)。ELISA法具有灵敏度高，

特异性强，精密度好，操作简单，适用于多份标本的检测，不需特殊仪器设备等优点，易于

推广普及。但不适合急诊的快速检测。

以双抗法为例。首先包被抗原，然后加入一抗，使一抗与包被抗原形成抗原—抗体复

合物。接着加入酶标二抗，形成抗原—抗体—抗体复合物。最后加入底物，由酶催化底物生

成产物。通过产物的生成量即可对蛋白抗原进行定量。

4）偶联生物素—亲和素系统的酶免法

利用了一个亲和素分子可以与4个生物素分子结合的特性，使传统的灵敏度较高的酶

免法的灵敏度又有明显的放大作用。

5）时间分辨荧光免疫分析

时间分辨荧光免疫分析（TimeresolvedFluorimmunoassay，TRFIA）是一种非同位素

免疫分析技术，它用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分

辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的

干扰，极大地提高了分析灵敏度。

6）解离增强镧系元素荧光免疫分析

解离增强镧系元素荧光免疫分析（DissociationEnhancedLanthanideFluorimmunoassay

DELFIA）是时间分辨荧光免疫分析中的一种。它用具有双功能基团结构的螯合剂，使其一

端与铕（Eu）连接，另一端与抗体/抗原分子上的自由氨基连接，形成EU标记的抗体/抗原，

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经过免疫反应之后生成免疫复合物。由于这种复合物在水中的荧光强度非常弱，因此加入一