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ELISA实验中本底及假阳性产生的原因分析

1.基因工程抗原与合成肽抗原的区别

基因工程抗原是抗原基因在质粒载体中原核或真核表达的蛋白质抗原，多以大肠杆菌或酵母菌

为表达系统。该类抗原与合成肽相比具有以下特点：

a.分子量大。合成肽采用化学方法制备，由于工艺的局限，合成数量有限，只能达到数百个氨基

酸；而利用基因工程制备的抗原，分子量更大。

b.稳定性好。包被的抗原的稳定性可使试剂盒的效期得到保证，早期以合成肽为包被抗原的试剂

盒效期只有3-4个月，采用基因工程抗原后效期大大延长了。

c.基因工程抗原将特异性抗原决定簇基因融合表达，表达产物包含更多的抗原决定簇，可提高试

剂盒的灵敏度，提高检出率。

d.纯化难度大。基因工程抗原的纯化技术难度较大。

合成多肽抗原是根据蛋白质抗原分子的某一抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。合

成肽抗原有以下特点：

a.分子量太小

b.一般只含有一个抗原决定簇

c.纯度高

d.稳定性差

由于基因工程抗原较于合成肽抗原有无可比拟的优越性，ELISA诊断试剂经历了从合成肽向基因

工程抗原的过渡。就HCVELISA试剂盒来讲，第一代产品为合成肽抗原，主要是HCV特异性抗

原决定簇的肽片段；第二代产品包被的抗原既有基因工程抗原又有合成肽，只是当时的基因工程

抗原不全，仅包括了HCV的核心区片段；第三代产品基本上采用了基因工程抗原，而且这些抗

原包括更多、更稳定、纯度更高的HCV特异性抗原。第三代试剂的敏感度大大提高了。

由于历史的原因，人们往往以反应本底的好坏来衡量ELISA反应试剂盒，因此有些厂家为了保

持较好的本底采用了单片段基因工程抗原及合成肽包被，该类试剂盒的流行病学敏感度不够，稳

定性也成问题。值得欣慰的是也有厂家坚持试剂盒高的流行病学敏感度，科学得对待反应结果。

2．假阳性本底产生的原因

2.1抗原因素

2.1.1融合蛋白对基因工程抗原特异性的影响。以丙肝诊断试剂盒为例为例，因为包被的基因

工程抗原为融合蛋白，包含了来自表达载体的一些序列，因此可以与血清中抗大肠杆菌的因子发

生反应而产生了可疑标本。

2.1.2错误排序的影响。合成肽在制备过程中，如果某些肽序列错误，会导致合成肽特异性改变

而产生假阳性。另外，在构建基因工程表达载体时引入的HCV核苷酸发生相位改变或点突变也

会对抗原的特异性产生不利的影响，但由于基因工程技术的不断进步，由工艺原因造成的抗原特

异性降低会逐渐被克服。

2.2.3抗原纯度对特异性的影响。以HCV抗原为例，利用大肠杆菌大规模表达后需经破碎细胞、

盐析、粒子交换柱等分离纯化步骤才能最后的到一定纯度的HCV抗原。目前的工艺还不能做到

抗原纯度为100％，因此抗原中还混有大肠杆菌的其它杂蛋白，受过大肠杆菌感染的人，血清中

的抗大肠杆菌抗体可和这些杂蛋白产生反应而引起假阳性。

人血清中的正常IgG

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人血清中IgG的浓度对HCV试剂盒有较大的影响。HCV试剂盒采用的间接法，酶标抗抗体能与

人所有IgG结合，而IgG吸附于板孔的能力很强，因此我们采用100微升样稀加10微升血清

来将其稀释以降低本底。到成人时，据统计学调查，成人的IgG为12mg/ml，而有些人的IgG浓

度会远远高于此，这部分人的血清经ELISA反应后往往会显色。

人血情中异常的IgG

结缔组织病（系统性红斑狼疮、多发性骨髓瘤等）等病症时，血清中的风湿小体和其它异常IgG