核酸扩增技术专家讲座.pptVIP

核酸扩增技术温州医学院检验医学院、生命科学学院SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege核酸扩增技术专家讲座第1页

主要内容第一节聚合酶链反应技术第二节荧光定量PCR技术第三节其它核酸扩增技术第四节临床基因扩增试验室管理与质量控制SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege核酸扩增技术专家讲座第2页

第一节聚合酶链反应技术

polymerasechainreaction,PCR一、PCR技术发展简史二、PCR技术原理三、PCR反应体系、条件及其优化四、扩增产物检测及分析五、PCR常见问题与原因分析六、PCR衍生技术SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege核酸扩增技术专家讲座第3页

PCR技术发展简史Korana于1971年最早提出核酸体外扩增构想。1985年Mullis等创造了含有划时代意义聚合酶链反应,使用DNA聚合酶是Klenow片段。(1993年诺贝尔化学奖取得者)SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege核酸扩增技术专家讲座第4页

PCR技术发展简史1988年初,Keohanog改用T4DNA聚合酶进行PCR。1988年Saiki发觉TaqDNA聚合酶,从此PCR技术得以广泛应用。SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege核酸扩增技术专家讲座第5页

基本原理N=N0(1+E)cSchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege核酸扩增技术专家讲座第6页

PCR反应体系、条件及其优化PCR反应体系模板（template）引物（primers）DNA聚合酶(DNApolymerase)dNTPPCR缓冲液（PCRbuffer）PCR反应条件变性退火延伸循环SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege核酸扩增技术专家讲座第7页

DNARNA：总RNA.mRNA.tRNA.rRNA.病毒RNA基因组DNA质粒DNA

模板（template）SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege核酸扩增技术专家讲座第8页

引物（primers)引物是人工合成两段寡核苷酸序列,一个引物与感兴趣区域一端一条DNA模板链互补,另一个引物与感兴趣区域另一端另一条DNA模板链互补。→←3’3’5’5’SenseprimerAntisenseprimerSchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege核酸扩增技术专家讲座第9页

引物主要性在整个PCR体系中,引物占有十分主要地位。PCR特异性要求引物与靶DNA特异结合,不与其它非目标DNA结合,PCR灵敏性要求DNA聚合酶能对引物进行有效延伸,可见引物设计好坏与PCR结果亲密相关。SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege核酸扩增技术专家讲座第10页

引物设计总标准引物与模板序列要紧密互补引物与引物之间防止形成稳定二聚体或发夹结构引物不能在模板非目标位点引发DNA聚合反应(即错配)。SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege核酸扩增技术专家讲座第11页

引物设计普通标准引物长度碱基分布均衡性Tm值引物二级结构引物3’端引物5’端引物内部稳定性引物保守性与特异性扩增区域二级结构SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege核酸扩增技术专家讲座第12页

引物长度普通为15-30个核苷酸，惯用是18-24bp。在做长片段PCR或做一些特殊PCR时应使用较长引物，但最多不超出50个核苷酸。引物过短会引发错配现象，普通来说引物长度大于16bp是必要（不轻易引发错配）。比如:一个长度为12bp引物在人类基因组上存在200个潜在退火位点(3x109/412=200).而一个长度为20bp引物在人基因组上存在退火位点只有1/400个.较长引物（28-35bp)普通是用来区分同源性较高模板序列或者使用于产生一些突变位点