PCR原理完整版本.pptVIP

引物浓度与PCR引物浓度：一般为0.1-0.5umol/L简单的配算方法：配置贮存浓度为50μM引物需要的体积=（nmol数×20）μl上下游引物各取20μl+60μl水=10μM的混合引物50μlPCR反应体系中加入1μl浓度为10μM的混合引物即可(反应浓度为0.2umol/L)引物与PCR退火温度退火温度最适退火温度（TaOpt）=0.3×(Tmofprimer)+0.7×(Tmofproduct)–25一般采用较引物Tm值低5℃作为PCR退火温度。条件允许的情况下，可以通过梯度PCR摸索最适退火温度引物设计软件NCBIPrimerBLASTPrimer3OligoPrimerPremier5.0ThePrimerGeneratorNetPrimerPrimerPremier5.0使用介绍PreimerPremier启动界面Loadsequence基本信息SequencenameOriginalsequenceUsethesetwobuttontotranslatetheDNAseqtoaproteinseqoraproteinseqtoaDANseq8种密码子偏好Chooseafunction引物设计界面FirstyoucandesigntheprimermanuallySensestrandoranti-sensestrandUsefulinformationoftheprimer引物搜索选项设定引物类型搜索模式5’引物位置范围3’引物位置范围产物大小范围引物长度搜索结果28对引物引物分值100分为满分每对引物的信息双击选中一对引物引物信息回到主窗口引物及产物信息是否出现hairpin,dimer,falseprimingandcrossdimer引物编辑引物编辑EditprimerhereAnalysistheeditresultAccepttheeditresultReturntothemainwindowNCBIPrimerBLAST优点：自动分析引物的特异性可以选择跨内含子设计引物输入基因号或基因序列输入扩增片段长度范围输入引物TM值范围选择上下游引物必须跨内含子设计得到的引物与基因数据库进行比对谢谢！聚合酶链式反应（PCR）

原理及引物设计逆转录PCR(RT-PCR)先以RNA为模板，在逆转录酶作用下合成cDNA；然后以cDNA为模板，在DNA聚合酶的作用下扩增特定目的基因通常用于检测特定基因mRNA在样本中的表达水平PCR反应分为三步：DNA模板变性(denaturing)在93-95℃之间使模板充分变性单链DNA模板与引物退火(annealling)55℃左右，此温度选择根据模板和引物配对结合强弱而定，是反应特异性的决定因素之一引物延伸(extension)70-72℃左右，为Taq酶最适反应温度。PCR法的操作过程Step1:DNA热变性Step2:引物退火Step3:引物延伸5572经典循环参数（500bp以内）94℃30s50℃45s72℃1min94℃5min×30次72℃10min4℃foreverPCR反应五要素：●模板DNA：50-200ng，高纯度，增加反应特异性●PCR用引物：根据目的基因两侧特定序列设计。约20bp左右；Ｇ＋Ｃ含量在45-55％之间；内部不能有回文序列；３’端不能互补。●PCR用DNA聚合酶：嗜热杆菌、耐热95℃●PCR用Buffer：Mg2+是辅基（2.0-3.0mM）浓度太低酶活力降低；太高反应特异性降低。●dNTP：100μM～200μM实时荧光定量PCR

(RealtimeQuantitativePCR)在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析的方法。

与普通RT-PCR的区别

普通RT-PCR技术：在P