朱鹮性别鉴定技术规程(.pdf

朱鹮性别鉴定技术规程

1范围

本标准规定了聚合酶链式反应（PCR）方法鉴定动物性别的操作方法。

本标准适用于朱鹮（Nippoianippon）的性别鉴定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日

期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修

改单）适用于本文件。

GA/T383法庭科学DNA实验室检验规范

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

NY/T1903牛胚胎性别鉴定技术方法PCR法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本标准。

CHD1基因

鸟类性染色体连锁基因，在W和Z染色体上有两个CHD1等位基因。它们共有相

对保守的外显子，同时携带高度多态的内含子，通常这两个等位基因的核苷酸长

度不同，从而据此可判别雌雄个体。

EE0.6基因

鸟类性染色体连锁基因，其在所有鸟类中都趋于保守，该序列不仅存在于W

染色体上，在Z染色体上也存在对应的序列，但W染色体上的EE0.6序列与Z染色体

上的对应序列存在本质差异，可据此序列差异判别雌雄个体。

4原理

从被检个体中抽取血液，提取DNA，利用Z、W染色体上的CHD1和EE0.6基因序

列差异设计引物进行扩增和检测，根据扩增结果鉴定性别。

5取样

采集全血样本。将朱鹮翅膀张开，露出腋窝，即可见到明显的翼根静脉，使

用酒精棉球消毒皮肤。抽血时用左手拇指、食指压迫此静脉向心端，血管即怒张，

右手取1ml注射器，针头由翼根向翅膀方向沿静脉平行刺入血管内，抽取0.1ml血

液。

1

6鉴定

试剂和仪器设备

6.1.1主要试剂

DNA聚合酶、PCR预混液、dNTPs、DNAMarker、琼脂糖、电泳缓冲液。电泳

缓冲液配方见附录A表A.1。

6.1.2主要仪器

冷冻离心机、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、电子天平、恒温水浴锅、超

纯水仪、微量移液器。

鉴定过程

6.2.1DNA提取

6.2.1.1酚氯仿法

取80μL抗凝血于1.5mL离心管中，加入500μLTE缓冲液（配方见附录A

表A.1）、15μL的2.5%SDS和15μL蛋白酶K（10mg/mL）充分混匀，置56℃

水浴锅中消化过夜；加入等体积的PH8.0酚/氯仿/异戊醇溶液（25∶24∶1，

v/v/v）600μL，充分混匀10min，10000g离心10min；再取上清液，转入另

一离心管，加入氯仿/异戊醇（24:1，v/v）600μL，充分混匀10min，10000g

离心10min；再取上清液，转入另一离心管，加入等体积预冷的异丙醇沉淀DNA，

-20°C沉淀30min，10000g离心10min，小心弃去液体部分；加入70%乙醇（v/v）

洗涤DNA沉淀，悬浮沉淀，10000g离心10min；小心去除液体部分，将DNA沉淀

自然风干后加入100μLTE溶解。

6.2.1.2硅胶柱法

以天根TIANampBloodDNAKit为例，取20μL抗凝血，加入20μL蛋白酶

K溶液，混匀；加200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，56℃放置10min，其间颠

倒混匀数次，溶液应变清亮；加200μL无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会

出现絮状沉淀；将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中，10000g，

离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中；向吸附柱CB3中加

入500μL已加入无水乙醇缓冲液GD，10000g，离心30s，倒掉收集管中的废液，

将吸附柱CB3放入收集管中；向吸附柱CB3中加入600μL已加入无水乙醇漂洗液

PW，10000g，离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中；向

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吸附柱CB3中加入600μL已加入无水乙醇漂洗液PW；10000g，离心2min，倒掉

废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；

将吸附柱CB3转入1.5mL离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50~200μL洗脱