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静注加替沙星在家兔体内的药代动力学研究
静注加替沙星在家兔体内的药代动力学研究
一.实验目的:
1.了解加替沙星的药理学作用和临床血药浓度监测方法;
2.熟悉家兔静脉注射药物和股动脉采血的操作;
3.建立测定家兔血清中加替沙星药物浓度的高效液相方法;
4.掌握分析数据的方法以得到相关药代动力学参数。
二.背景:
喹诺酮类药物是一种DNA旋转酶抑制剂,它作用于细菌DNA旋转酶,干扰DNA超螺旋结构的解旋,从而阻碍DNA的复制,而呈现杀菌作用。该类药物的共同特点是:抗菌作用强大,抗菌谱较广,主要对抗革兰阴性菌,对革兰阳性菌也有相当作用。
加替沙星(Gatifloxacin)为第三代喹诺酮类药物,为8-甲氧氟喹诺酮类外消旋化合物,体外具有应谱的抗革兰氏阴性和阳性微生物的活性,其R-和S-对映体抗菌活性相同。
据文献报告,加替沙星口服吸收良好,且不受饮食因素影响,其绝对生物利用度为96%,药物浓度在服用1-2小时后达峰。他体内的分布较广,可进入大多数药物不能进入的骨、关节和前列腺组织等。加替沙星的临床有效性评价在国外报道较多,而国内关于加替沙星临床试验的报道较少。
在本实验中,对健康家兔耳缘静脉注射加替沙星之后,药物会在体内血液中进行二房室模型分布,分别在不同时刻进行血液采集,用高效液相色谱法对各时刻血浆内药物浓度进行检测,可以绘制加替沙星注射液在家兔体内药代动力学曲线,并可以据此进行相关药代动力学参数的计算。
三.实验试剂与仪器:
3.1动物:健康家兔1只(雌雄均可)
3.2试剂:
加替沙星氯化钠注射液,1mg/ml加替沙星溶液,20%乌拉坦,肝素生理盐水,10%高氯酸,90%甲醇,醋酸铵15mM/L,醋酸,乙腈,蒸馏水
3.3仪器:
恒温兔台,手术仪器一套,头皮针,注射器,抗凝管,动脉夹,插管,棉线
SHIMADZUHPLC色谱仪:SHIMADZUCTO-10AS柱温箱,LC-20AT液相色谱仪,SPD-20A紫外检测器,自动进样器,数据处理工作站,高速离心机,涡旋震荡仪
四.实验条件及试剂选择:
4.1取血点的选择
对于一个较完整的体内药代动力学曲线,采血时间点应至少在吸收相取2个,平衡相去2个,消除相取5个,保证取血持续时间为3-5个半衰期,最后一个取血点处药物浓度至少低于110Cmax。对于加替沙星消除半衰期t1/2=1.4292(h),因此本实验中取血点定在2,5,10,15,30,45,60,90,120min。
4.2取血方式及血量
鉴于如果采用颈动脉会影响家兔呼吸,而且给药时家兔双耳分别用于麻醉和加替沙星的给药,但动脉血量更丰富,因此本次实验采用耳缘给药,股动脉插管取血。由于家兔血量有限,其中血浆量占全血量40-50%,血清量仅占全血量10%左右,因此在不影响家兔生存,且可以得到足够分析需要样本量的条件下,本次实验采用家兔全血提取的血浆进行检测,每次取血0.5ml。
4.3样品处理
标准曲线的绘制和采集的9个血样浓度的测定应平行操作。由于实验时间的关系,我们分两次操作。但处理方法需保持平行:100μl血浆(标准液10μl和空白血浆90μl)+100μl10%高氯酸涡旋振荡3min,12000rmp离心10min进而取上清进样。这样标准曲线绘制的时候的浓度为在加入空白血浆后的这100μl体系的浓度。
4.4色谱条件
色谱柱:C184.6×150mm
流动相:水相:醋酸铵15mM/L,用醋酸调至PH3.0
有机相:乙腈
水相:有机相=78:22
流速:1ml/min
检测波长294nm
柱温:40℃
检测顺序:由低浓度到高浓度
五.实验步骤:
5.1给药及取血
取家兔一只,称重,将家兔以乌拉坦5ml/kg麻醉,背位固定于手术台上。在一侧腹股沟部搏动处剪毛,用1ml1%盐酸普鲁卡因作皮下局麻。纵切皮肤3~4cm,分离股动脉,在动脉下穿双线,结扎近心端,作静脉切口,插入与注射器相连的静脉插管(内充满肝素化盐水),结扎固定,检查取血是否顺利。耳缘静脉给药加替沙星1ml/kg,药物全部推入之后立即开始计时,于2,5,10,15,30,45,60,90,120min处取血各0.5ml,加入抗凝剂涡旋混匀,高速离心(4000r/min)15min。取上层清夜,静置冷藏保存。
5.2标准曲线的绘制
5.2.1标准待测溶液配制
由1mg/ml的加替沙星母液稀释配制500μg/ml,250μg/ml,125μg/ml,62.6μg/ml,31.2μg/ml,15.6μg/ml,7.8μg/ml,3.9μg/ml系列浓度的加替沙星标准溶液。各浓度标准溶液取10μl分别加入90μl空白血浆中,混匀,分别加入10
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