地中海贫血基因检测 PCR扩增DNA.pptx

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PCR扩增DNA

地中海贫血基因检测

实验目的

1、掌握PCR的原理

2、熟悉PCR操作过程

3、了解PCR的临床应用

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实验原理

PCR（PolymeraseChainReaction）：聚合酶链式反应，

PCR过程类似于DNA的天然复制过程，包括DNA双链解开，引物配对，合成三步；

在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。

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PCR

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动画演示

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α-地贫实验原理（四重Gap-PCR）

根据α-地贫3种缺失范围及断裂点，分别设计特异引物同时检测，在3种缺失片段的共同区域还设计一对正常内对照引物，当发生任一种缺失纯合子或双重杂合子该正常对照不扩增;根据阳性扩增片段组合结果诊断各种不同基因型。

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α-地贫基因缺失示意图

a3.7

a4.2

--SEA

ψα2

ψα1

α2

α1

1

ζ

ψζ

正常内对照

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β-地贫PCR实验原理

设计特异的PCR引物且其5‘端用生物素进行标记，扩增获得一定长度的DNA片段，该片段包含了所要检测的各个位点。

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What’sinthePCRTube

TargetDNA

5’

3’

3’

5’

primers

A

B

Free

nucleotides

TaqDNA

polymerase

Mg2+

Mg2+

Mg2+

Mg2+

Mg2+

Mg2+

Buffer

containing

magnesium

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PCR原理:实质就是体外基因复制技术

.

加热变性95°C

靶序列引物退火55°C

引物延伸72°C

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PCR扩增（α-地中海贫血）

PCR-Mix-I（蓝色管）21μL

DNA模板 4μL

Total25μL

96℃5min

98℃45sec

65℃90sec

72℃3min

98℃30sec

65℃45sec

72℃3min

72℃10min

（25cycles）

（10cycles）

操作步骤

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PCR扩增（β-地中海贫血）

用生物素标记的引物扩增待测样品DNA

PCR-Mix-I（紫色管）23μL

DNA模板 2μL

Total25μL

50℃ 15min

95℃ 10min

94℃1min

50℃ 30s35cycles

72℃ 30s

72℃ 5min

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试剂

试剂盒组成：

（1）PCR反应液

（已包含PCR扩增所需的缓冲液、引物、dNTPs、DNA聚合酶等）

（2）纯水

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仪器设备

离心机

加样枪

PCR扩增仪（使用介绍）

1、PCR扩增循环条件的设置(PCR仪请使用热盖)：若用没有热盖的PCR扩增仪，则需在反应体系中加入液体石蜡等矿物油封闭体系以防止反应过程中液体的蒸发。

2、扩增结束后，不立刻电泳请取出放冰箱保存

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操作步骤

1取出冻存的DNA解冻

2试剂准备

取所需的反应管PCRMix-A,若管盖上有液体附着的请低速离心数秒

3、加样

在反应管上做好标记，分别加2-4ul已提取的待测样品、阴性质控、阳性质控，终反应体积为25ul，低速离心数秒。转移至扩增区

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质量控制

1阴性质控（灭菌双蒸水）

2阳性质控（缺失型/突变型）

随病人标本检测,不同缺失/突变类型可以依次轮流循环作为质控检测

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PCR常见问题之一

假阳性

现象：空白对照出现目的扩增产物

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PCR常见问题之二

无扩增产物

现象：正对照有条带，而样品则无；

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注意事项

1、在运输过程中会有PCR反应液附着在管壁/盖上，因此请在使用前先离心，以保证PCR反应体系的体积及防止潜在的污染。

2、PCR反应的加样量多数是微量的，所以加样时应把枪头伸进液面下加样，并注意确保试剂确实加进去了！

3、加样过程中注意防止污染样品及试剂。

4、置PCR仪进行PCR反应前，PCR管要盖紧，否则使液体蒸发影响PCR反应。

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思考

1、试述PCR技术的基本原理。

2、问：在Gap-PCR中为什么α正常DNA序列不能生成相应的