第5章-分子生物学基本研究方法4-研究DNA-蛋白质互作的方法.ppt

第五章分子生物学基本技术

——研究DNA与蛋白质相互作用的方法凝胶阻滞试验用途足迹试验的优点DNasel足迹试验发展3甲基化干扰试验甲基化干扰试验的具体操作4体内足迹试验思考题分子生物学与基因工程西北师范大学精品课程武国凡2015.11分子生物学与基因工程第五章分子生物学基本技术——核酸蛋白互作西北师范大学精品课程武国凡2015.11分子生物学与基因工程第五章分子生物学基本技术——核酸蛋白互作西北师范大学精品课程武国凡2015.11又叫做DNA迁移率变动试验，是80年代初出现的用于在体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。简单、快捷，是当前被选作分离纯化特定DNA结合蛋白质的一种典型的实验方法。1凝胶阻滞试验原理特殊细胞提取物中，是否存在可同放射性标记的探针DNA结合的蛋白质分子（比如。。。。。）研究发生此种结合作用之精确的DNA序列的特异性：其办法是在DNA一蛋白质结合反应体系中，加入超量的非标记竞争DNA。。。。。。检测突变对DNA与转录因子结合作用的影响2DNasel足迹试验可以形象地展示出一种特殊的蛋白质因子同特定DNA片段之间的结合区域。使用较大的DNA片段，通过足迹试验便可确定其中不同的核苷酸序列与不同蛋白质因子之间的结合位点的分布状况。可以加入非标记竞争DNA，来消除特定的足迹，据此确定其核酸序列的特异性。硫酸二甲脂（DMS）足迹试验:DMS能够促进DNA中裸露的G甲基化，而六氢吡啶又会对甲基化的G残基作特异的化学切割。假如有一种蛋白质同DNA分子中的某一区段结合，在它的保护下，区域内的G免受六氢吡啶的切割，于是在DNA片段的序列梯中，便不存在具这些G残基末端的DNA片段，故出现个空白区域，此即通常所说的足迹。由于DMS足迹试验中被切割的是G残基，因此可用来鉴定同转录因子蛋白质结合的DNA区段中的特异碱基。检测靶DNA中特异G残基的优先甲基化对尔后的蛋白质结合作用究竟会有什么效应，从而更加详细地揭示DNA与蛋白质之间相互作用的模式。先用硫酸二甲脂（DMS）处理靶DNA，控制反应条件，使平均每条DNA分子只有一个G甲基化，而后将这些局部甲基化的DNA群体同含有DNA结合蛋白的适当的细胞提取物一道温育，并作凝胶阻滞试验。经电泳分离之后，从凝胶中切取阻滞条带和非阻滞条带，并用六氢吡啶处理之。。。。用有限数量的化学试剂DMS处理完整的游离细胞，并使其渗透到细胞内的浓度恰好导致天然染色质DNA中的G残基发生甲多化。而后取DNA，加入六氢吡啶作体外消化。结果：缺少了G残基没有被切割的相应条带（图）。