番茄细胞周期基因cyca21亚细胞定位初探.docx

摘要

番茄是世界性的种植作物，近年来人们通过科研手段研究着番茄的品质开发。番茄的果实大小是番茄重要的外在品质，番茄的果实尺寸大小是番茄细胞数和细胞大小共同组合的结果，而细胞的分裂和扩展决定决定了番茄的细胞数和细胞大小。细胞周期影响着番茄细胞的细胞数与细胞大小，CYCA2;1作为番茄的核细胞周期相关基因，其基因表达对细胞周期有影响。通过亚细胞定位的方法，确定了该基因在细胞核中表达，为后续研究CYCA2;1基因的功能奠定基础。

关键词：番茄；细胞周期；CYCA2;1；亚细胞定位

前言

番茄在茄科类蔬菜中有着重要地位，在美洲大陆发现后被广泛的传播，现已成为了世界性的种植作物。番茄经由传教士从欧洲传到了亚洲大陆的我国，而且随着近年来栽培面积的不断增加，番茄逐渐成为了群众生活中不可或缺的蔬菜。番茄日渐与人们的生活密不可分，不仅是作为蔬菜，它也渐渐以水果的身份出现在人们视线中。在科学技术水平发达的当代，科研人员们关注的不仅是番茄的抗病抗逆性，还有番茄的品质。番茄的果实大小是番茄重要的外在品质，番茄的果实尺寸大小是番茄细胞数和细胞大小共同组合的结果，而细胞的分裂和扩展决定决定了番茄的细胞数和细胞大小。在真核生物中，细胞周期由四个不同的阶段组成，一个是具有2C核DNA含量的的未分化的DNA合成前期，称为G1期；一个是合成DNA的S期，该时期核DNA含量在2C和4C之间；具有4C核DNA含量的第二个未分化阶段的（DNA后合成阶段）的G2期；还有一个M期，或者说是有丝分裂期。保守的异位蛋白复合物组成的核心调节剂的活性能够确保细胞周期的进展。这些复合物由细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）和调节细胞周期蛋白（CYC）亚基的催化亚基形成。细胞周期蛋白通常有两种类型。一个是G1-S期的cyclins,该类型的细胞周期蛋白通常是响应外部信号，比如说激素；或者是内部信号，比如生长速度和细胞大小。另一个与之相反，是S期的CyclinA和有丝分裂细胞周期蛋白CyclinB。他们以细胞周期依赖的方式显示调节合成和销毁，因此它们的丰度取决于细胞在循环中的位置而不是外部信号。核细胞周期相关基因的家族十分庞大，已有研究显示，在番茄中有61个核细胞周期相关基因。而调节Cyc的存在对于CDK-Cyc复合体是必不可少的，因为它赋予其稳定性，其定位及其基质特异性。前人对细胞周期蛋白调查的论文中发现了一对细胞周期蛋白，这与后人研究显示的与一个单个的激酶亚基有联系的A型和B型细胞周期蛋白相对应。A型细胞周期细分为三个不同的亚类，Cyca1，Cyca2和Cyca3。这三种不同的CYCA种类在植物中有不同功能，他们在细胞周期中差异调节，CACY3细胞周期蛋白从G1/S期和S期期间表达，而CYCA1和CYCA2基因G2/S期有一个表达的峰值。通过阅读文献，我们了解到有研究表明CYCA2;1细胞周期相关基因的过表达与拟南芥的叶片的运动相关，且CYCA2;1基因的表达对后续的细胞有丝分裂期也产生影响。

细胞内的RNA通过模板链合成肽链再经过后续一系列的蛋白质，产生的蛋白质要在特定的亚细胞器里面才能发挥它应有的作用，通过亚细胞定位，我们可以了解蛋白或者基因的表达产物其表达产生后会具体在细胞的哪一个部位，从而产生后续的调控作用。是表达在细胞核中，细胞质中还是细胞膜上，确定好这个才能准确的研究蛋白质的功能。亚细胞定位通过荧光蛋白GFP与目的基因结合在一起，再在一定的细胞中表达调控，通过在显微镜下观察融合蛋白荧光的位置从而确定目的基因到底在哪一个细胞位置表达。我们通过亚细胞定位确定细胞周期相关基因CYCA2；

1的具体表达位置，从而可以进行后续的研究探索。

材料与方法

试材

本实验于2021年3月15日至2021年4月15日于山东农业大学本部科创楼808进行。本实验选取较新鲜，生活力强的洋葱和番茄苗作为实验试材，观察细胞周期基因在洋葱内表皮中的亚细胞定位。

实验方法

总RNA的提取

在实验开始前要做好充足的实验准备，提前准备钢珠，1.5ml和2ml的离心管、PCR管、实验需要的黄蓝白枪和

50ml离心管。提前将这些实验用品需高压灭菌备好。实验时戴好口罩，换一副新的橡胶手套，防止RNA酶降解RNA。

具体步骤如下：

样品处理：拿出灭好菌的2ml的离心管，标上编号。取番茄生长点下幼嫩叶片、番茄的整花置于离心管中，盖上离心管盖子，丢入液氮中。

戴好手套，将样品从液氮中取出放入打样机，调整打样机的频率为40HZ/s，打样时间为40s。启动打样机，将样品进行研磨。

将研磨好的样品置于蓝板上，快速开盖，每个样品加入1mltrizol，涡旋振荡，使样品充分化开。

将样品静置5min，加入200ul氯仿，盖板大力摇晃15s，静置2min。

放入离心机中，以4℃，10000rpm