02 聚合酶链式反应(PCR)基本操作步骤.pdf

聚合酶链式反应(PCR)

聚合酶链式反应{PolymeraseChainReaction，PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的

一种方法,为最常用的分子生物学技术之一。典型的PCR由(!)高温变性模板;{2)引物

与模板退火;(3)引物沿模板延伸三步反应组成一个循环,通过多次循环反应,使目的DNA

得以迅速扩增。其主要步骤是;将待扩增的模板DNA置高温下(通常为93C-94C)使其

变性解成单链,人工合成的两个考核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的

两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短;耐热的DNA聚

合酶{Taq酶)在72习将单核昔酸从引物的3端开始掺入，以目的基因为模板从5一3方向

延伸，合成DNA的新互补链。

PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段，并能轻易在皮克(pg)水平起始

DNA混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA片段。因此，PCR

技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。它不仅可以用于基因的分离、

克隆和核阁酸序列分析,还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多

态性的分析，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。通常，PCR

在分子克隆和DNA分析中有着以下多种用途:

(0D生成双链DNA中的特异序列作为探针;

(2)由少量mRNA生成cDNA文库;

G)从cDNA中克隆某些基因;

(4)生成大量DNA以进行序列测定;

(5)突变的分析;

(6)染色体步移;

(7)RAPD、AFLP、RFLP等DNA多态性分析等。

一、试剂准备

1.DNA模版

-对应目的基因的特异引物

3.10xPCRBuffer

4.2mMdNTPmix:含UHATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

5.Taq酶

二、操作步又

1.在冰滩中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。

10xPCRbuffer区

dNTPmix(2mM)《互

引物L(IO0pM)w正

引暂2(10pM)区

名名(是兰)1由

DNA模板(50ng-lhg/)-三

加ddH20至50品

视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。

2.调整好反应程序。将上述混合液稍如离心,立即置PCR仪上,执行扩增。一般:在93C

预变性3-5min，进入循环扩增阶段:9人40s一58C30s一72C60s，循环30-35次，最后

在727C保温7?min。

3.结束反应，PCR产物放置于4C待电泳检测或-207C长期保存。

4.PCR的电泳检测:如在反应管中加有石蜡油，需用100ht氧仿进行抽提反应混合液，以

除去石蜡油;否则,直接取5-10hl电泳检测。

三、PCR反应体系的组成与反应条件的优化

PCR反应体系由反应缓冲液(10xPCRBuffer)脱氧核首三磷酸底物(dNTPmix)耐

热DNA聚合