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DB××/T××××—2021

小叶白蜡组织培养技术规程

1范围

本文件规定了小叶白蜡（FraxinusbungeanaDC.）组织培养技术的培养基制备、无菌体系建立、培养条件、初代培养、继代培养、增殖培养、生根培养、炼苗、驯化移栽、苗期管理、定植、技术档案管理等技术内容。

本文件适用于辽宁省范围内小叶白蜡的组织培养育苗。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6001育苗技术规程

LY/T1882林木组织培养技术规程

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

小叶白蜡FraxinusbungeanaDC.

又名小叶花曲柳、小叶梣，属木犀科（Oleaceae）白蜡树属（Fraxinus）落叶小乔木或灌木。其生物学特性、生态学特性及用途参见附录A。

4培养基制备

4.1培养基配制、灭菌及保存

按照LY/T1882的规定执行。

4.2培养基选择

诱导培养基：WPM+20g/L蔗糖+6g/L琼脂；继代增殖培养基：WPM+0.5mg/L6-BA+0.05mg/LNAA+20g/L蔗糖+6g/L琼脂；生根培养基：WPM+1.0mg/LIBA+0.5mg/LNAA+20g/L蔗糖+6g/L琼脂。pH5.6~5.8。

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5无菌体系建立

将种子灭菌后接种在诱导培养基上启动培养，待种子萌发真叶长出后，再继续进行继代增殖培养。

5.1种子选取与采集

于秋季种子成熟后，选择连续3d以上的晴天，从生长健康、无病虫害、已结实的小叶白蜡母株上选取成熟饱满的种子，置于自封袋内带回。

5.2种子预处理

首先将种子进行4℃冷藏处理24h~72h。取出后置于流水下冲洗20min，去除表面脏物。再放于洗衣粉水中浸泡30min，期间不断刷洗种子，进行深层清理，并去掉种翅。然后种子置于流水下冲洗1h~2h，用干净滤纸吸干水分，移至超净工作台备用。

5.3种子灭菌处理

将种子倒于无菌烧杯中，用70％酒精浸泡30s，期间不断摇晃烧杯以保证每粒种子都能充分接触到酒精，之后用无菌水反复冲洗4次~5次，再用0.1％升汞分别灭菌8min~12min，立即用无菌蒸馏水反复仔细冲洗5次~7次，每次停留1min~2min，之后取出种子放在盛有无菌滤纸的接种盘上，吸干水分备用。

5.4初代培养

将无菌接种盘中已吸干水分的种子用无菌手术刀和镊子去掉外种皮，接种于诱导培养基上，5d后外植体开始萌动，表现为在种子的下胚轴露出白色胚根，叶片颜色健康，大小正常，种子萌发率高达91%，可以快速获得无菌苗。

6培养条件

培养室内温度25±2℃,湿度40%~50%，光照强度2000Lx~3000Lx，光周期12h~16h，培养周期6周~8周。

7继代培养

将已萌发的无菌苗培养2周~3周后，转接种到继代培养基上进行继代培养，每个培养瓶内接种2株~3株，并分布均匀。

8增殖培养

当无菌苗长到苗高为3cm~5cm时，将无菌苗剪接成2个~3个带芽茎段转接到新鲜的培养基上继续培养，增殖培养周期为20d~30d。

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9生根培养

当增殖培养获得一定数量无菌苗后，选取生长健壮的无菌苗转接入生根培养基上进行生根培养，培养2周后可见有根长出，4周后平均生根条数＞5条。

10炼苗

生根后2周~3周，选取根长1.5cm~2.5cm、须根不少于3条的试管苗，将其放置温室自然散射光下，打开培养瓶盖炼苗2d~3d，控制温度在18℃~28℃。

11驯化移栽

炼苗后，从培养瓶中取出试管苗，用流水冲洗掉粘附于根部的培养基，放入准备好的托盘中，用纱布盖好，待用。以草炭土、蛭石配比为1：1混合作为移栽基质，并加入0.5g/L的多菌灵搅拌均匀，然后装入穴盘中，移入试管苗，扶正，使根系尽量舒展，用基质将根埋好并压紧。每天用细雾喷壶喷水，使环境湿度保持在90%左右，安装遮阴网进行遮阴处理。经过30多天的驯化，当苗木表现为叶色深绿，叶片增大，有新叶长出，根毛增多，可移栽至营养钵。

12苗期管理

12.1水肥管理

移栽后，在遮荫且通风条件下培养4d~5d，每天向叶面喷水1次，1周后，撤掉遮荫，并注意通风。夏季施氮肥2-3次