琼脂糖凝胶电泳的操作步骤(精).pdf

琼脂糖凝习电泳站用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。对于分了量

较大的样品,如大分子核酸、病毒等,一般可采用和孔径较大的琼扬糖凝胶进行电泳

分离。

琼脂糖谋胶约可区分相养100bp的DNA片段,其分辩率虽比聚丙燃酰胺凝胶

低,但它制备容易,分离范围广,尤其适十分离大片段DNA。普道壤脂糖凝胶分离

DNA的范围为0.2-20kb,利用脉冲电泳,可分离高达10^7bp的DNA片段。

操作流程

准备干净的配胶板和电泳模

注意DNA了污染的仪器可能会降解DNA,造成条带信号弱、模糊甚全缺失

的现象。

选择电泳方法

一般的核酸检测只需要静脂精凝胶电泳就可以;如果需要分辨率山的电泳,特别

是只有几个bp的差别应该选择聚丙烯酰胺凝胶电泳;用普通电瀛不合适的巨大

DNA链应该使用脉冲凝胶电瀛。注意巨大的DNA链用普通电泳可能跑不出胶孔

导致缺带。

正确选择凝胶浓度

对于琼脂糖凝胶电泳,浓度通常在0.5~2%之间,低浓度的用来进行大片段核酸

的电泳,高浓度的用来进行小片段分析。低浓度胶易碎,小心操作和使用质量好的

琼脂糖是解决办法。注意高浓度的眩可能使分子大小相近的DNA带不易分辨,造

成条带缺失现象。

适合的电泳缓冲液

常用的缓冲液有TAE和TBE,而TBE比TAE有着更好的缓冲能方。电泳时

使用新制的缓冲液可以明显提高电沪效果。注意电泳缓冲液多次使用后,离子强度

降低,PH值上才,绥冲性能下降,可能使DNA电泳产生条党模糊和不规则的DNA

带迁移的现象。

电泳的合适电频和兆度

电泳时电压不应该超过20VAem,电泳温度应该低丁30C,对本巨大的DNA电

泳,温度应该低于1$SC。注意如果电泳时电上计和温度过高,可能导致出现条

带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。特别是电压太大可能导致小片段跑出

胶而出现缺带现象

DNA样品的纯度和状态

是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象DNA样品的纯度和状态注

意样品中含盐量太高和含杂质蛋白均可以产生条带模糊和条带缺失的现象。乙本

沉淀可以去除多余的盐,用酚可以去除蛋白。注意变性的DNA样品可能导致条带

模糊和缺失,也可能出现不规则的DNA条带迁移。在上样前不要对DNA样癌如热，

用20mMNaCIl缓冲液稀释可以防止DNA变性。

DNA的上样

正确的DNA上样量是条带清晰的保证。注意太多的DNA上样量可能导致

DNA带型模糊,而太小的DNA上样量则导致带信号弱甚至缺失。TIANGEN公司

DNA分子量标准每次上桩6ul即可得到清晰均匀的条带。

Marker的选择

DNA电泳定划使用DNAMarker或已知大小的正对照DNA来估计DNA片

段大小。Marker应该选择在目标片段大小附近