蛋白质组学总结.pptVIP

脉冲激光使样本离子化，在外加电场作用下获得动能，进入高真空无电场飞行管道，以在加速电场内获得的速度飞行。质量较小的离子飞行速度快，到达检测器早；质量较大的离子飞行速度慢，到达检测器晚。*§2肽质量指纹谱鉴定蛋白质技术特定的质量，且产生的片段数目亦有特异性，故称指纹谱。肽质量指纹谱(peptidemassfingerprinting,PMF)是指蛋白被酶切位点专一的蛋白酶水解后，得到的肽片段质量图谱。由于所产生的肽段具有特定序列、长度，因而具有*为什么要酶切蛋白样品？蛋白分子往往有许多的修饰位点，而且这些修饰未必均一，因而，难以通过质量直接确定样品为何种蛋白。但如果进行酶切后，产生了多条肽段，其中有些肽段是没有修饰位点或未被修饰的，其质量信息，能准确反应肽段的氨基酸构成情况，在数据库中查找、比对时，便可知这类肽段源于何种蛋白，进而确定样品是何种蛋白。这是对蛋白分子进行胶上酶切的重要原因之一。此外，酶切产生肽段数目固定，是肽质量指纹图谱的重要信息；18O从头标记也需要对蛋白分子进行酶切。*常用酶类要求：水解为点专一；切出的肽段适合质谱分析（约几千Da），利于检索；酶自身稳定，不易降解。常用酶类：胰蛋白酶和Glu-C蛋白酶等。*§3液相色谱—电喷雾—串联质谱一、电喷雾电离源的工作原理利用高压电场使进样端的毛细管流出的液滴带电，在N2气流作用下：液滴溶剂蒸发——表面积减小——表面电荷密度不断增加——库伦斥力与表面张力达到雷利极限——液滴爆裂为带电的子液滴；这一过程不断重复，最终液滴非常细小，称喷雾状，表面电场强大，使分析物离子化，以带单电荷或多电荷离子形式进入质量分析器。**电喷雾电离产生多电荷离子：可以用质谱仪的小的质量范围测定大的生物分子，相当于将质谱仪的质量范围放大的n倍。*多电荷离子的有关计算：对于蛋白质，产生的多电荷离子为：[M+nH]n+系列离子。假设某一质谱峰(m/z)1对应的离子为[M+nH]n+,另一相邻质谱峰(m/z)2对应的离子为[M+(n+1)H](n+1)+,且两个峰均为同一蛋白质产生，则可通过建设联立方程组来得到M和n的具体数值:解方程组得到M和n。可以编制程序将所有相关的峰进行计算并取平均值，则可得到较精确的分子量信息。这一过程称作解卷积(Deconvolution)。*二、液相色谱—电喷雾—串联质谱(LC-ESI-MS/MS)ESI后连接串联质谱，可检测离子结构碎片和质荷比，提供离子结构（比如序列）的信息，应用于核酸、多肽及蛋白的鉴定和翻译后修饰的分析。串联质谱仪离子源多级质量分析器碰撞室一级质量分析器总离子母离子碰撞室二级质量分析器子离子产生分析核质比母离子经高速惰性气体碰撞诱导解离，产生碎片离子/子离子*三级四极杆质量分析器是怎样测定多肽序列的？由三个顺序连接的四极杆构成，第一、三个四级杆分别用于母离子和子离子选择，第二个充当碰撞室。由电喷雾离子源生成的总离子经过第一个四极杆（一级质量分析器），筛选出特定离子——母离子——进入后续检测；母离子进入第二个四极杆（碰撞室），经高速惰性气体碰撞诱导解离，产生碎片离子（子离子）；子离子由第三个四极杆（二级质量分析器）分析其质荷比。最后，根据母离子产生的各种子离子的质荷比计算出子离子的质量，根据断裂处相邻的子离子的质量差，确定氨基酸残基，进而推算出氨基酸序列。*小肽断裂碎片离子定义by四肽a、b、c型离子保留肽链N端，电荷留在离子C端x、y、z型离子保留肽链C端，电荷留在离子N端*二、18O标记从头测序技术肽段的断裂主要形成b或y型离子，但判断受样品纯度、溶液中盐分因素制约，有时不易读出。同时为保证能够只读出含有肽段原始末端的y型离子，解决办法——蛋白质在酶解时，酶解液中H218O和H216O各占50%，这样酶解后肽段的羧基端上的羟基氧的18O/16O同位素丰度比为1：1，使得y型离子系列的M+2/M的同位素峰的丰度比远高于正常未标记18O离子的同位素峰的丰度比，从而比较容易地分辩出y系列离子，用这种方法可以较准确地读出10个以上的氨基酸序列。*四极滤质器（QuadrupoleMassFi