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松树苗期线虫病抗性检测技术规程

1范围

本文件规定了线虫收集与分离、虫源鉴定、线虫培养与扩繁、苗木准备、人工接虫、接虫次数、感病指数、抗性评价、技术档案管理的技术要求。

本文件适用于松树苗期松材线虫病抗性的检测和评价技术工作。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB6000主要造林树种苗木分级

GB/T6001-1985育苗技术规程

GB/T35342-2017松材线虫分子检测鉴定技术规程

LY/T1000容器育苗技术

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

松材线虫pinewoodnematode(Bursaphelenchusxylophilus)

无脊椎动物，属线虫门(Nematoda)、侧尾腺纲(Secernentea)、滑刃目(Aphelenchida)、滑刃总科(Aphelenchoidoidea)、滑刃科(Aphelenchoididae)、伞滑刃亚科(Bursaphelenchinae)、伞滑刃属(Bursaphelenchus)的植物寄生线虫。

3.2

松材线虫病pinewiltdisease

又称松树萎蔫病，是由松褐天牛(Monochamusalternatus)为主要媒介昆虫、松材线虫寄生于松树引起的一种森林毁灭性病害。

3.3

人工接虫artificialinsemination

采用人工皮接法，采用解剖刀在松树茎干上割开树皮，深及木质部，掀开树皮塞入大小合适的棉球，并用封口膜将其包裹好，最后注入线虫悬浮液。

3.4

感病指数susceptibilityindex

按照病害轻重划分为若干等级，调查时按病害程度分别将受测株归入合适的等级中，然后统计出各级被害木的百分率。

4线虫收集与分离

采用贝尔曼漏斗法，具体包括以下步骤：

——准备宽10cm～20cm的玻璃漏斗，末端接15cm左右长的乳胶管，将套有乳胶管的玻璃漏斗放置在漏斗架上；

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——乳胶管上安装弹簧止水夹，往玻璃漏斗中缓慢注入适量无菌水，将乳胶管底部气泡排出，观察乳胶管是否漏水，若漏水需夹紧或更换止水夹；

——将疫木劈成长约5cm、宽约0.5cm的碎木条，用两层纱布或纸巾包裹后放入漏斗中，漏斗处贴上标签，沿漏斗内壁缓慢注入适量无菌水至浸没样品；

——疫木浸泡12h后，松开止水夹，用干净小培养皿或离心管收集线虫悬浮液5ml～15ml。

5虫源鉴定

5.1形态学鉴定

形态学具体步骤如下：

——将分离获得的线虫杀死，制作临时玻片，在显微镜下观察；

——雌雄虫呈蠕长形，虫体细长；唇区高，缢缩显著；口针细长，基部稍增厚，中食道球卵圆形；

——雌成虫单卵巢，前伸、直，有较宽阴门盖，尾部末端宽圆呈指状；

——雄成虫交合刺大，弓状，成对，喙突显著，远端膨大如盘状，尾部圆锥形，向腹弯曲似鸟抓，末端被一卵形交合伞包裹。

5.2分子鉴定

线虫分子鉴定参照GB/T35342执行。

6线虫培养与扩繁

6.1线虫培养

线虫采用PDA-灰葡萄孢平板培养基培养，具体步骤如下：

——在直径9cm培养皿中加入30ml的PDA培养基，PDA培养基配方为马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂18g，水1000ml，接入灰葡萄孢，经25℃恒温培养7d；

——待葡萄孢长满平板，接入经鉴定的雌、雄成虫各10条，25℃恒温暗培养使线虫繁殖；

6.2线虫扩繁

视线虫繁殖情况7d~15d进行继代扩繁培养。

7苗木准备

苗木准备具体步骤如下：

——在培育好的I级容器苗木中挑选苗高相对一致，无病虫害的健壮苗木30株；

——容器苗的出圃规格、包装与苗木运输按执行LY/T1000的规定；

——苗木质量检验按GB6000规定执行；

——采用随机区组设计，小区株数10株，分3次重复定植在检测大棚内，各畦四边分别设置保护行，扶下压实（可降解容器带营养袋种植，不可降解需剥袋种植），浇足定根水；

——视不同区域不同季节常规管护15d~20d，至苗木生长稳定。

8人工接虫

人工接虫具体步骤如下：

——选择气温30℃左右的晴朗天气，苗木接虫前统一浇透水；

——在接种枝条的一侧用锋利刀剥开长约1cm割口，割口剥至形成层和木质部，用移液枪将0.2ml线虫悬浮液均匀注入切口，切口加浸湿的棉花保湿，视温湿度情况补充棉花水份；

——接种量为每株5000头~10