蛋白质制备及含量测定(凯氏定氮法).docVIP

实验六蛋白质制备及含量测定——

微量凯氏〔Mirco-Kjeldahl〕定氮法

一、实验目的要求

1、了解蛋白质提取的一般方法和原理

2、了解蛋白质含量测定的常用方法

3、学习微量凯氏定氮法的原理

4、掌握微量凯氏定氮法的操作技术，包括样品的消化、蒸馏、滴定、含氮量的计算及蛋白质含量的换算等。

二、实验原理

1、蛋白质的提取与制备

蛋白质的提取与制备方法与生物材料的类型及蛋白质的存在部位有关。如果是胞内蛋白，首先必须要进行细胞破碎。细胞破碎的方法与细胞的类型有关，包括物理破碎〔研磨、超声波等〕、化学破碎〔化学溶剂处理〕、酶法破碎等。如果是胞外蛋白，可以根据相应蛋白质的性质进行提取别离纯化。

如果待提取的蛋白质是具有生物活性的蛋白质如酶，那么在样品处理、提取及别离纯化过程中需注意防止蛋白质的变形失活，如在低温下操作、选择适当的缓冲体系等。

2、蛋白质含量测定

蛋白质含量测定的方法很多，如：紫外吸收法、双缩脲法、考马斯亮蓝染色法〔Bradford法〕、Folin酚法、微量凯氏定氮法等。

3、凯氏定氮

生物材料的含氮量测定在生物化学研究中具有一定的意义，如蛋白质的含氮量约为16％，测出含氮量那么可推知蛋白含量。生物材料总氮量的测定，通常采用微量凯氏定氮法。凯氏定氮法由于具有测定准确度高，可测定各种不同形态样品等两大优点，因而被公认为是测定食品、饲料、种子、生物制品、药品中蛋白质含量的标准分析方法。其原理如下：

〔1〕消化：有机物与浓硫酸共热，使有机氮全部转化为无机氮——硫酸铵。为加快反响，添加硫酸铜和硫酸钾的混合物；前者为催化剂，后者可提高硫酸沸点。这一步约需2～3h，视样品的性质而定。

天然的含氮有机物〔如蛋白质，核酸及氨基酸等〕与浓硫酸共热时，其中的碳、氢二元素被氧化成二氧化碳和水；蛋白质分解，而有机氮那么变成氨〔无机氮〕，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。此时程称之为“消化”。

但是，这个反响进行得比拟缓慢，通常需要参加硫酸钾或硫酸钠以提高反响的沸点，并参加硫酸铜作为催化剂，以促进反响的进行。甘氨酸的消化过程可表示如下：

NH2-CH2-COOH+3H2SO4→NH3+2CO2↑+3SO2↑+4H2O

2NH3+H2SO4→(NH4)2SO4

或2NH2-CH2-COOH+7H2SO4→(NH4)2SO4+4CO2↑+6SO2↑+8H2O?

〔2〕加碱蒸馏：

浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借水蒸汽将产生的氨蒸馏到一定量、一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后，氨与溶液中的氢离子结合，生成铵根离子。

(NH4)2SO4+2NaOH→Na2SO4+2NH3+2H2O

NH3+H3BO3→NH4H2BO3

或2NH3+4H3BO3→(NH4)2B4O7+5H2O

〔3〕滴定：

硼酸吸收氨后，氨与溶液中的氢离子结合，生成铵离子，使溶液中氢离子浓度降低。然后用标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原来氢离子浓度为止，最后根据所用标准酸的当量数物质的量〔相当于待测物中氨的物质的量〕计算出待测物中的含氮量，再折算为粗蛋白含量。

NH4H2BO3+HCl→NH4Cl+H3BO3

或(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O→2NH4Cl+4H3BO3

滴定时用甲烯蓝和甲基红混合指示剂，其指示范围为pH5.2~5.6，将NH4H2BO3的绿色滴至原来H3BO3的紫色即为终点。

本法适用于0.2~1.0mg〔2.0mg〕氮量测定。相对误差应小于2%。

图3－1微量凯氏蒸馏装置示意图

1.热源2.烧瓶3.玻璃管4.橡皮管5．玻璃杯6.棒状玻塞7.反响室8.反响室外壳9.夹子10.反响室中插管11.冷凝管12.锥形瓶13.石棉网

?

?

?图3－2改良型微量凯氏定氮蒸馏装置

1.水蒸气发生器2.反响室3.水蒸气排气孔4.排水排气孔5．外源水入口6.进样口7.加样漏斗8.冷凝器9.冷凝器出口10.自来水入口11.通气室12.通气室出口13.通气室出口14.排水柱15.排水柱入口16.排水柱入口17.冷凝水和废水出口

?三、主要实验试剂和器材

1、试剂

〔1〕消化液〔过氧化氢∶浓硫酸∶水＝3∶2∶1〕

〔2〕硫酸钾—硫酸铜混合物：硫酸钾与硫酸铜〔CuSO4·5H2O〕以3：1〔W/W〕的配比混合研磨成粉末。

〔3〕30%氢氧化钠溶液

〔4〕2%硼酸

〔5〕混合指示剂〔田氏指示剂〕的配制：

方法一：取50mL0.1%甲烯蓝无水醇溶液与200mL0.1%甲基红无水乙醇溶液混合配成，贮于棕色瓶备用，这种指示剂酸性时为紫色，碱性时为绿