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针对H5N1流感疫苗的新型佐剂的设计与研究

H5N1禽流感严重威胁着人类生命健康,目前,商品化的H5N1疫苗多为安全性

较好的灭活疫苗。然而,在鼻黏膜免疫中,灭活疫苗难以克服鼻腔黏膜屏障。

在注射免疫中,H5Nl灭活疫苗也存在不能诱导理想的免疫反应、需要很高抗

原用量以及现有商品化铝盐佐剂效果不佳等问题。针对此现状,本文选用两种生

物可降解高分子聚合物材料,壳聚糖和聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA),分别制备温

敏水凝胶与均一的非球形PLGA颗粒用作黏膜免疫与注射免疫佐剂,以增强H5Nl

灭活疫苗的免疫效果。

针对温敏水凝胶,考察凝胶的物化特性对免疫效果的影响,阐述其作用机制,

并开展安全性与稳定性研究,推进其临床前研究。针对PLGA颗粒,开发简单有效

的制备均一变形颗粒的方法,并比较球形与非球形颗粒的免疫效果,探讨非球形

颗粒应用于H5Nl灭活疫苗的可行性。

具体研究内容分为以下几个部分：(1)采用放大工艺合成壳聚糖季铵盐

(HTCC),通过与甘油磷酸钠(GP)离子交联制得HTCC温敏性水凝胶并用于H5N1疫

苗的黏膜免疫佐剂。通过调控HTCC季铵取代度来调节凝胶的阳离子性和流变学

特性,考察其物化特性对免疫效果的影响。

结果表明,季铵取代度居中的41%的HTCC水凝胶既具有合适的黏度和温敏性

能延长抗原在鼻腔的停留,又具有一定阳离子性能增强与黏膜的吸附,并打开上

皮细胞间通道以促进抗原的渗透,最终更好地实现了体液免疫效果的提升。动物

实验表明,41%凝胶组血清IgG抗体滴度是纯抗原滴鼻组的5.5倍,并接近纯抗原

注射组的水平(0.7倍),黏膜IgA抗体滴度达到注射组的170倍。

(2)针对第一章中优化的水凝胶,系统考察了该凝胶佐剂的安全性。通过急毒、

长毒、异常毒性、过敏反应、热原、溶血等实验验证了所开发的HTCC温敏水凝

胶是一种经鼻应用安全、毒副作用很低的黏膜免疫佐剂。

(3)进一步采用在FDA处有备案的壳聚糖谷氨酸盐(CS-Glu)制备水凝胶佐剂,

通过正交实验同时优化凝胶的有效性与稳定性。结果表明,凝胶疫苗制剂中,抗原

剂量对免疫效果的影响作用最大,CS-Glu与GP的影响作用较接近。

最后,进一步配方优化后的水凝胶制剂能显著提升纯抗原的体液免疫效果

(2.4倍),HI平均滴度可达120,黏膜免疫IgA抗体为注射组的178倍。该制剂在

25±l。

C环境下能稳定6天,2～8℃下已经稳定存放两个月,具有临床应用潜力。(4)

针对非球形颗粒佐剂制备困难,导致对其形状特性考察不足的问题,采用磷酸缓

冲盐(PBS)作为变形引发剂,利用微孔膜乳化技术成功制得不同形状的均PLGA颗

粒。

该方法能同时实现对形状、形貌和粒径的三重控制,并可以实现规模化制备,

为其临床应用奠定基础。通过将非球形颗粒用作H5N1裂解疫苗的注射免疫佐剂,

初步阐释了形状对免疫效果的影响。

其中球形颗粒能更好地提升体液免疫效果,而杆状颗粒则能促进T细胞的活

化以及T细胞免疫记忆的产生。本论文采用壳聚糖和PLGA两种高分子聚合物材

料,开发了H5N1疫苗黏膜免疫和注射免疫佐剂,探讨了佐剂物化特性、流变特性

以及形状与免疫效果的关系,并开展了疫苗制剂的安全性和稳定性评价,为实现

临床应用奠定基础。