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课题6血红蛋白的提取与分别学问点总结

一,试验原理

蛋白质的物化理性质：形态,大小,电荷性质与多少,溶解度,吸附性质,亲与力等千差万别，由此提取与分别各种蛋白质。

1．凝胶色谱法（安排色谱法）：

（1）原理：分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流淌快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流淌慢。

（2）凝胶材料：多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖,琼脂糖。

（3）分别过程：

混合物上柱→洗脱→大分子流淌快,小分子流淌慢→收集大分子→收集小分子

洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流淌。

（4）作用：分别蛋白质，测定生物大分子分子量，蛋白质的脱盐等。

2．缓冲溶液

（1）原理：由弱酸与相应的强碱弱酸盐组成（如H2CO3－NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等），调整酸与盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。

（2）缓冲液作用：抵制外界酸,碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定。

3．凝胶电泳法：

（1）原理：不同蛋白质的带电性质,电量,形态与大小不同，在电场中受到的作用力大小,方向,阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向与运动速度不同。

（2）分别方法：琼脂糖凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳等。

（3）分别过程：在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质－SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。

二,试验步骤

1．样品处理

红细胞的洗涤

洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白，采集的血样要刚好采纳低速短时间离心分别红细胞，然后用胶头吸管吸出上层透亮的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的生理盐水，缓慢搅拌10min，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。

②血红蛋白的释放

在蒸馏水与甲苯作用下，红细胞裂开释放出血红蛋白。

注：加入蒸馏水后红细胞液体积与原血液体积要相同。加入甲苯的目的是溶解细胞膜，有利于血红蛋白的释放与分别。

2．粗分别

①分别血红蛋白溶液

将搅拌好的混合溶液离心后，试管中的溶液分为4层。第一层为无色透亮的甲苯层，第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质的沉淀层，第3层是红色透亮液体，这是血红蛋白的水溶液，第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，除去之溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透亮液体。

②透析

取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量的浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中，透析12h。透析可以去除样品中分子量较小的杂质，或用于更换样品的缓冲液。

3．纯化

调整缓冲液面：打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝

↓胶面平齐，关闭出口。

加入蛋白质样品：用吸管将透析后的样品沿管壁环绕移动加到色谱柱的顶端。加样后，

∣打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全渗入凝胶层后，

↓关闭出口。

调整缓冲液面：加入20mmol/L的磷酸缓冲液到适当高度

洗脱：连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口，进行洗脱。

收集分装蛋白质：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集。

4.纯度鉴定------SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（选做）

三,留意事项

电泳技术

电泳技术就是在电场的作用下，利用待分别样品中各种分子带电性质以及分子本身大小,形态等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而达到对样品进行分别,鉴定或提纯的目的。

2.红细胞的洗涤

假如分层不明显，可能是洗涤次数少,未能除去血浆蛋白的缘由。此外，离心速度过高与时间过长，会使白细胞与淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。

3．如何检测凝胶色谱柱的装填是否胜利

由于凝胶是一种半透亮的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得匀称。

此外，还可以加入大分子的有色物质，视察色带移动的状况。假如色带匀称,狭窄,平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。假如色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消退气泡，消退不了时要重新装柱。

4．为什么凝胶的装填要紧密,匀称？

假如凝胶装填得不够紧密,匀称，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液的流淌次序，影响分别的效果。

5．沸水浴处理加入洗脱液的湿凝胶的目的

不但节约时间，还能除去凝胶中可能带有的微生物与解除凝胶内的空气。

6．G-75

“G”代表凝胶的交联程度，膨胀程度及分别范围，75表示凝胶得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5g。

7．装填完后，马上用洗脱液洗脱的目的