糖代谢与控制 (2).ppt

3、选择显色圈大的突变株在麦芽汁培养基中加入pH指示剂，如0.1%溴酚蓝，将黑曲霉诱变后于33℃在该培养基中培养3天，柠檬酸产量越高，显色圈的直径就越大。第63页,共70页，5月，星期六，2024年，5月4、选育耐高渗透压的突变株高产柠檬酸菌株，在高糖、高柠檬酸培养基中仍称保持正常生长，并具有代谢能力。选育在16-25%甘薯粉的平板上生长良好的突变株；选育在含10-20%柠檬酸培养基（10%甘薯粉，2%琼脂）上生长良好的突变株。第64页,共70页，5月，星期六，2024年，5月5、选育不分解利用柠檬酸的突变株选育在以柠檬酸为唯一碳源的培养基上菌体不生长或生长较弱的突变株；选育乌头酸酶活性低的突变株。第65页,共70页，5月，星期六，2024年，5月6、选育形态突变株黑曲霉形态突变与柠檬酸产量之间有一定的关系。选育菌落直径约为正常型菌落直径1/3以下的S型小菌落，菌落凸起，孢子着生稀疏；选菌丝、孢子颜色较浅的突变株；选孢子紧密而细小的突变株；选在葡萄糖合成培养基中孢子不长、迟长或少长的突变株。第66页,共70页，5月，星期六，2024年，5月7、选育单氟乙酸、三氟乙酸或2,4-二硝基酚敏感突变株单氟乙酸在体内可转化成单氟柠檬酸，其对乌头酸酶产生竞争性抑制。如菌体对单氟乙酸敏感，说明该突变株的乌头酸酶活力低下或乌头酸酶含量少。因此选育单氟乙酸敏感突变株，有助于柠檬酸的高产。第67页,共70页，5月，星期六，2024年，5月选育氟丙酮酸敏感突变株该突变株体内丙酮酸向乙酰CoA的反应弱，CO2固定反应所占的比例相对较大。选育丙氨酸缺陷或渗漏突变株选育丙氨酸温度敏感型突变株选育天冬氨酸缺陷或渗漏突变株加大生物素用量，激活丙酮酸羧化酶将PEE基因或丙酮酸羧化酶基因克隆到高拷贝载体质粒上，使之扩增。8、选育强化CO2固定反应的突变株第68页,共70页，5月，星期六，2024年，5月9、选育某些氨基酸缺陷突变株或抗药性突变株第69页,共70页，5月，星期六，2024年，5月感谢大家观看第70页,共70页，5月，星期六，2024年，5月**p243**P245，并参见生物化学**现普遍认为，黑曲霉利用糖类生产柠檬酸的途径是：G经EMP或HMP降解，形成丙酮酸，一方向氧化脱羧成乙酰CoA，另一方经CO2固定羧化成草酰乙酸，后草酰乙酸与乙酰CoA缩合成柠檬酸。**黑曲霉中也存在TCA和乙醛酸循环的酶系，但在产柠檬酸阶段，这两个循环均被阻断或减弱。因此，合成柠檬酸所需的草酰乙酸必须由含二碳的羧酸来提供。黑曲霉主要是通过丙酮酸羧化酶的催化作用，使丙酮酸固定CO2成草酰乙酸。草酰乙酸不是油TCA提供，而是2个CO2固定提供，因此固定对柠檬酸合成并不可少。由于黑曲霉不存在苹果酸脱氢酶。**另发现，黑曲霉除存在正常呼吸链外，还存在一旁系呼吸链，该链在完成H传递过程中产生ATP。因此通过旁系呼吸链也能减少对PFK的抑制作用。**在葡萄糖合成培养基中，若菌体大量积累柠檬酸，自然使TCA循环的中间产物减少，而这些中间产物是形成孢子所必需的。大量柠檬酸积累的结果，势必造成孢子不长、迟长或少长。第31页,共70页，5月，星期六，2024年，5月⑶选育L-Trp缺陷、L-Tyr缺陷、L-Phe缺陷、CoQ缺陷、维生素K缺陷或叶酸缺陷突变株。原理同莽草酸缺陷突变株。第32页,共70页，5月，星期六，2024年，5月3、其它标记据报道，在维持转酮酶缺陷的情况下，进一步诱变，使菌体带上具有高葡萄糖脱氢酶活性和丧失孢子形成能力等标记，可使菌体的D-核糖积累量大幅度提高。葡萄糖脱氢酶是芽孢杆菌属细菌的孢子所特有的酶，该酶由于NAD、NADP和NADH2、NADPH2会发生分子型的变换，结果在菌体对数生长期被诱导，导致D-核糖的大量积累。第33页,共70页，5月，星期六，2024年，5月4、利用基因工程技术构建核糖工程菌株岩盾等人将枯草芽孢菌染色体DNA中的转酮酶基因克隆到载体质粒pUB110中，再将氯霉素酰基转移酶基因插入到转酮酶基因之中，造成转酮酶基因的不可逆失活。经限制性内切酶酶切后得到线状重组质粒，将该重组质粒转化到枯草芽孢杆菌宿主中，构建出转酮酶失活的D-核糖工程菌株，其D-核糖积累量达52g/L。第34页,共70页，5月，星期六，2024年，5月小林等人将葡萄糖脱氢酶基因克隆到穿梭载体质粒pHY300PLK中，然后转化到枯草芽孢杆菌中，构建出D-核糖工程菌株，能积累49g/LD-核糖。第35页,共70页，5月，星期六，2024年，5月5、发酵控制D-核糖的发酵培养基的碳源可以使用葡萄糖、D-甘露糖、山梨醇、