葡萄植株中7种植物激素含量的测定 液相色谱-质谱质谱法.docxVIP

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葡萄植株中7种植物激素含量的测定液相色谱-质谱/质谱法

1范围

本文件描述了液相色谱-质谱/质谱法测定葡萄植株中7种植物内源激素含量的原理，规定了试剂和材料、仪器和设备、分析步骤、结果计算和表述、精密度等的要求。

本标准适用于葡萄植株的叶、芽、果等组织中玉米素、玉米素核苷、赤霉素A3、生长素、水杨酸、茉莉酸、脱落酸含量的测定。

本标准的方法检出限详见附录A中表A.1。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

植物激素planthormone

由植物自身合成，通常自产生部位移动到作用部位，并在极低浓度下具有显著生理作用的微量有机物质，也被称为植物天然激素或植物内源激素。

4原理

试样用异丙醇混合溶液低温震荡提取植物激素，经反相色谱柱分离，液相色谱-质谱/质谱法进行测定，外标法定量。

5试剂和材料

除非另有说明，本方法使用的试剂均为色谱纯；水为符合GB/T6682中规定的一级水。

5.1异丙醇。

5.2甲醇。

5.3二氯甲烷。

5.4盐酸，优级纯。

5.5异丙醇+水+盐酸（2+1+0.003）：取20mL异丙醇（5.1）加10mL水，再加入0.03mL盐酸（5.4），混匀。

5.650%甲醇溶液：取50mL甲醇（5.2）加50mL水，混匀。

5.7植物激素标准品：玉米素、玉米素核苷、赤霉素A3、生长素、水杨酸、茉莉酸、脱落酸，化合物信息详见附录A中表A.1，纯度均≥98%。

5.8单一标准储备液：分别准确称取各植物激素标准品（精确至0.1mg）至棕色容量瓶中，加入甲醇（5.2）溶解配成浓度为1000μg/mL的标准储备溶液，于-80℃避光保存，有效期为6个月。

5.9混合标准储备液：分别吸取7种植物激素标准储备液0.1mL（5.8），置于10mL棕色容量瓶中，用甲醇（5.2）稀释成浓度为10μg/mL的混合标准储备液，于-80℃避光保存，有效期为3个月。

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5.10混合标准工作溶液：分别准确吸取一定量的混合标准储备液（5.9）于10mL棕色容量瓶中，加入已预冷的50%甲醇溶液（5.6）定容稀释成浓度为0.02ng/mL~100ng/mL的植物激素混合标准工作溶液，临用新配。

5.11液氮。

5.12滤膜：0.22μm滤膜，有机相。

6仪器和设备

6.1液相色谱-质谱/质谱仪：配电喷雾离子源（ESI）。

6.2电子天平：感量0.1mg。

6.3涡旋混匀器。

6.4低温震荡仪：温度可至5℃。

6.5超低温冰箱：温度可至-80℃。

6.6氮吹仪。

7分析步骤

7.1样品制备

分别取新鲜的葡萄植株的叶、芽、果等部位供试样，迅速用超纯水洗净样品附着的杂物，表面水分用吸水纸擦干，立即保存于液氮中。将样品从液氮中取出，置于研钵中加液氮磨细，混匀，立即转移至-80℃冰箱避光保存。

7.2试样处理

称取0.2g（精确至0.1mg）制备好的试样于15mL塑料离心管中，加入2mL预冷（4℃)的提取剂（5.5），置于5℃震荡仪中以200r/min振荡1h，再加入4mL预冷（4℃)的二氯甲烷（5.3），继续震荡1h，取二氯甲烷层氮吹至近干。加入0.5mL预冷（4℃)的50%甲醇溶液（5.6）复溶，漩涡混匀，经0.22μm滤膜过滤，滤液供液相色谱-质谱/质谱仪测定。

7.3仪器参考条件

7.3.1液相色谱参考条件

a）色谱柱：BEHC18柱，2.1mm×100mm，粒度1.7μm，或性能相当者；

b）流动相：流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为甲醇，梯度洗脱程序见表1；c）流速：0.3mL/min；

d）柱温：40℃;

e）进样量：5μL。

3

表1流动相梯度洗脱程序

时间/min

流动相A体积分数/%

流动相B体积分数/%

0

80

20

6

50

50

8

0

100

10

0

100

10.1

80

20

13

80

20

7.3.2质谱参考条件

a）离子源：ESI源；

b）扫描方式：正离子扫描模式和负离子扫描模式（