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苹果轮纹病菌快速检测方法

1范围

本标准规定了用环介导等温扩增（LAMP）快速检测苹果轮纹病菌的测定方法。

本标准适用于苹果叶片、枝条和果实中苹果轮纹病菌的快速检测。方法检出限：10-7ng/μL苹果轮纹病菌DNA。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测

3原理

3.1扩增原理

根据苹果轮纹病菌的ITS序列中特异性序列设计特异性内、外引物及环引物各一对，特异性序列参见附录A。三对引物特异性识别靶标序列上的六个独立区域，利用Bst酶启动循环链置换反应，在ITS基因序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物，加入显色液即可通过颜色变化观察判定结果。

3.2显色液显色原理

SYBRGreenI是一种高灵敏度的DNA荧光染料，可以嵌入方式结合到双链DNA的小沟内。当它与双链DNA结合时，荧光信号是游离状态的800～1000倍。在不发生扩增反应时，SYBR染料分子的荧光信号不发生改变，颜色显现为橙色；当发生扩增反应时，随着双链DNA的增加，SYBR染料的荧光信号也随之大幅度增强，其信号强度可代表双链DNA分子的数量，同时颜色由橙色变为绿色。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

LAMP：环介导等温扩增（loop-mediatedisothermalamplification）

DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）

ITS：内转录间隔区（Internaltranscribedspacer）

2×LampMasterMix：等温扩增PCR混合液

Bst酶：BstDNA聚合酶（BstDNApolymerase）

5试剂和材料

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除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水为GB/T6682中规定的一级水。

5.1等温扩增PCR混合液（2×LampPCRMasterMix1)）：包含40mmol/LTris-HCl、20mmol/L(NH4)2SO4、

20mmol/LKC1（pH值为8.8）、16mmol/LMgSO4、2.0mmol/LdNTPs、0.2%TrionX-100。5.2BstDNA聚合酶：酶浓度8U/μL。

5.3显色液：SYBRGreenI荧光染料，1000×。

5.4引物：根据苹果轮纹病菌ITS基因序列设计一套特异性引物，包括外引物1（F3），外引物2（B3），内引物1（FIP），内引物2（BIP），环引物1（LF）和环引物2（LB）。外引物扩增片段长度：189bp，引物序列见附录A。

5.5DNA快速提取液：DNA-EZReagentsAll-DNA-Fast-Out2)。

5.6甜菜碱：5mol/L。

5.7离心管：0.1mL、1.5mL。

5.8塑料研磨棒：长度70mm，研磨头外径6.2mm，研磨头长度9.5mm。

6仪器设备

6.1恒温箱：满足65℃±3℃、80℃±1℃要求。

6.2移液器：量程0.5μL～10μL，量程10μL～100μL，量程100μL～1000μL。

7测定步骤

7.1试验设置

7.1.1阴性对照：采用不含有目标基因序列的苹果腐烂病菌（Valsamali）基因组DNA为模板。

7.1.2阳性对照：采用含有目标基因序列的苹果轮纹病菌（Botryosphaeriadothidea）基因组DNA为模板，浓度应略高于方法检出限。

7.1.3空白对照：以水代替DNA模板。

7.2试样采集

进行田间轮纹病菌快速检测时，切取约0.5cm×0.5cm待检测的苹果组织（果实、叶片、枝条），放置于1.5mL离心管中保存并标记。

7.3试样DNA提取

7.3.1将100μLDNA快速提取液加入到盛有试样的1.5mL离心管中，用研磨棒研磨5min。

7.3.280℃±1℃加热5min，如果是难以破裂的细胞和材料，则保温时间可以延长到10min～30min。

7.3.3用手振荡混匀后取裂解物直接进行LAMP反应。

7.4LAMP反应步骤

7.4.1反应体系

1)由生工生物工程（上海）