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解放军第三0二医院王海滨
写在课前的话
近几年在临床检测病毒核酸和细菌核酸上，荧光定量
PCR技术越来越广泛。但是如何进行治疗控制以及出现污染
后怎样进行清除污染？本文主要讲述怎样来防止污染的产
生。
一、荧光PCR定量的概述
（一）荧光PCR定量的原理
实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加
入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，
最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。常规
的PCR也就是电泳PCR，它是合成一个正向引物和反向引
物为目的模板，即DNA或RNA作为一个模板扩增，扩增后
通过跑电泳的方式来检测它存在与否，是相对量的变化。由
于跑电泳经常导致产物外泄，因此污染的几率比较高。
近几年PCR扩增时在参入一对引物的同时参入单个特
异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记单个
报告荧光基团和单个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团
发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的
5端～3端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和
淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，
即每扩增一条DNA链，就有单个荧光分子构成，实现了荧
光信号的累积与PCR产物构成完全同步。
通过荧光物质参入和TapMan探针技术来做实时荧光
PCR,避免了电泳检测结果的过程,使整个PCR过程从扩增
到检测都在一个封闭的状态。荧光集团目前临床常用的有两
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个，一个是SYBRgreen，一个是TapMan探针。SYBR
green是一类荧光染料，能与所有的DNA双链相结合，
对DNA模板没有选择性，所以特异性不如TaqMan探
针。变性后双螺旋变成单链，然后作为扩增的模板。在扩
增的过程中由变性到负性扩出了另一条链和模板DNA进行
退火变成双链。这时SYBRgreen染料与DNA双链结合,
发出荧光信号。用SYBRgreen荧光染料来作为指示剂时，
中间要加一个溶解曲线来证实它的特异性的问题。
另一个是TapMan探针，在两个引物中间设置一条特异
性的探针，它标记有荧光染料通过激发和检测的过程来检测
特异性扩增模板的存在。
（二）PCR原理图
（三）定量原理
定量原理：初始模板量的对数与C(T)循环数之间的线
性关系。初始DNA量越多,荧光达到某一值（域值）时
所需要的循环数越少。域值～Ct值，荧光曲线由潜伏期进
入对数期的拐点。Log浓度与循环数呈线性关系（如图二），
根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的
模板量
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图一为PCR扩增曲
线
图二为
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