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猪繁殖与呼吸综合征病毒GP4蛋白B细胞表位的初步筛选

王爱萍;陈冰;刘红亮;周景明;陈玉梅;刘燕凯;祁艳华;张改平

【期刊名称】《《西北农业学报》》

【年(卷),期】2019(028)010

【总页数】6页(P1561-1566)

【关键词】猪繁殖与呼吸综合征病毒;GP4蛋白;重叠多肽;B细胞表位

【作者】王爱萍;陈冰;刘红亮;周景明;陈玉梅;刘燕凯;祁艳华;张改平

【作者单位】郑州大学生命科学学院郑州450000

【正文语种】中文

【中图分类】S855.3

猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,PRRS)

是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的一类严重危害养猪业的高度接触性传染病[1]。

PRRSV是单股正链RNA病毒，属于套式病毒目(Nidovirales)，动脉炎病毒科

(Arterividae)[2]。PRRSV分为两种基因型：欧洲型(基因Ⅰ型)和北美洲型(基因Ⅱ

型)[3]。

PRRSV的基因组大小约15kb，包含至少12个开放阅读框(Openreading

frames,ORFs)，分别编码不同的病毒蛋白[4]。由ORF4编码的GP4蛋白参与病

毒的转运，在病毒复制中起重要作用[5]。GP4与GP2a、GP2b、GP3可形成异源

多聚体，在病毒感染中发挥关键作用[6-7]。有研究报道，GP4与GP2、GP3和

GP5相互作用，与CD163受体相识别，介导PRRSV侵染宿主细胞[8]。

PRRSV感染机体后，引发体液免疫应答，从而产生多种特异性抗体，有助于避免

机体再次感染。有研究证明，中和抗体在抗PRRSV感染中起重要作用[9-10]，相

关中和表位已有报道。本研究通过合成PRRSVGP4蛋白的重叠多肽，经多肽

ELISA筛选GP4蛋白的B细胞表位，旨在深入了解和研究GP4蛋白的B细胞表

位，为PRRSV的抗体检测及其表位疫苗的研究提供帮助。

1材料与方法

1.1试验动物血清

PRRSV阴性血清及JXA1-R毒株免疫的PRRSV阳性血清由郑州大学生命科学学

院动物分子免疫实验室保存。

1.2GP4重叠多肽的设计

根据GenBank数据库中发表的PRRSVGP4蛋白序列(GenBank:ACN93856.1)，

设计合成17条重叠多肽，每条多肽长18个氨基酸，相邻肽段重叠9个氨基酸残

基。覆盖了除去N端信号肽序列(前22个氨基酸)的完整的GP4蛋白，送由上海

吉尔生化有限公司进行合成，将重叠多肽分别命名为GP4-1～GP4-17。

1.3间接ELISA

将1mg多肽干粉溶于50μL二甲基亚砜(DMSO)中，每管5μL分装，冻存于-

80℃冰箱。

用碳酸盐缓冲溶液(CBS)将多肽稀释至10ng/μL，每孔100μL作为包被抗原，设

立3个平行对照，PRRSVN蛋白作为阳性对照。在用50g/L脱脂奶进行封闭后，

将PRRSV阴性血清和阳性血清按照1∶100的比例稀释作为一抗，HRP标记的羊

抗猪IgG(Goatanti-SwineIgG/HRP)以1∶5000的比例稀释作为二抗，最后避

光显色5min后终止，测定OD450nm值。

1.4Dot-ELISA

将条状硝酸纤维素膜(NC膜)在磷酸盐缓冲液(PBS)中完全浸湿，室温风干。将多肽

用PBS稀释至2μg/μL，取1μL点在膜上，干燥，PRRSVN蛋白作为阳性对照。

用50g/L脱脂奶封闭2h后，以1∶100稀释的PRRSV阴性血清和PRRSV阳性

血清为一抗，二抗是以1∶5000的比例稀释后的HRP标记的羊抗猪IgG，最后

化学发光法显示试验结果。

1.5抗免疫显性肽段抗体水平的测定

将筛选得到的免疫显性多肽用CBS稀释至10ng/μL，100μL/孔作为包被抗原，

设立3个平行对照，并以不相关多肽作为阴性对照。封闭液为50g/L脱脂奶，试

验猪免疫前的阴性血清和免疫后每周采血分离得到的