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自噬的WB检测指标的研究思路及方案

一、技术简介

1.微管结合蛋白1A/1B-轻链3的检测

目前使用最为广泛的自噬流检测方法是通过Westernblot检测

microtubule-associatedprotein1A/1B-lightchain3B(LC3B)

蛋白表达水平，但是如果没有自噬工具药作为对照，则观察到的

LC3B改变无法真实反映细胞内自噬流状态。例如LC3B-II增加既

可能是自噬活化后自噬小体增多而成，也可能是自噬溶酶体清除失败

所致。自噬流的检测方法较为复杂，单独使用现有的某一种技术方法

往往不能达到系统性检测自噬流，因此需要选择多种不同实验方法，

综合评价其检测结果才能较为客观地反映细胞自噬流状态。

2.使用自噬相关工具药物检测LC3B-I/II转化

到目前为止伴随使用自噬晚期抑制剂，通过检测LC3B-I/II转化

是自噬流检测的金指标。当使用自噬晚期抑制剂巴弗洛霉素A1

(bafilomycinA1,BafA1)刺激细胞时，细胞内自噬溶酶体降解被抑

制，此时观察到的LC3B-II的变化仅代表自噬小体数量的改变。当

细胞自噬流活化后，LC3B-II的含量会在使用BafA1的基础上进一

步增加，而当细胞自噬流阻断后,LC3B-II的含量则不会在使用Baf

A1的基础上发生改变。除BafA1外，其他一些能提高溶酶体pH

值的自噬晚期抑制剂也可以用于自噬流的检测。若待检测药物+Baf

A1组LC3B-II与仅BafA1处理组相比显著增加则代表所检测药

物可以增加自噬小体或自噬溶酶体的合成。相反，若处理组与对照组

相比，LC3B-II降低则代表处理药物减少自噬小体的合成。

3.应用GFP-LC3B剪切实验评价自噬流

GFP-LC3B融合蛋白不仅能够利用其荧光标签进行检测，还可利

用溶酶体对标签蛋白的切割通过Westernblot进行检测。GFP-

LC3B蛋白进入到自噬溶酶体内后LC3B部分对溶酶体中的蛋白水

解酶较为敏感，较容易被降解。而融合蛋白中的GFP部分则对于溶

酶体中的蛋白水解酶敏感性较低，不容易被降解。使用GFP抗体进

行Westernblot检测可能会检测到GFP-LC3B-I、GFP-LC3B-II

和游离GFP标签三个条带，若出现游离GFP标签条带则代表细胞

自噬流活化。此外,在检测同一细胞样品时还可以使用LC3B抗体检

测内源性LC3B-I向LC3B-II转化。值得注意的是游离GFP标签

的出现仅代表自噬流适度活化，当自噬流过度活化时细胞内自噬溶酶

体中的pH值进一步降低,其降解蛋白的能力进一步增强，因此

GFP标签蛋白也被逐渐降解消失。由此可见，若观察不到游离GFP

标签，则有可能是由于自噬流阻断，也有可能是由于自噬流过度活化

所致。当自噬流过度活化时，若想要观察到GFP标签条带则需要配

合使用低浓度自噬抑制剂，如氯化铵或氯喹。这些药物能中和溶酶体

中的酸性环境，又不完全抑制细胞自噬功能，但当自噬流阻断时即使

使用低浓度自噬抑制剂也无法观察到游离GFP标签。

4.自噬标志性蛋白

1）自噬标记蛋白LC3

微管相关蛋白1轻链3(LC3／Atg8)是自噬体膜上的标记蛋白。细胞

内存在两种形式的LC3蛋白，LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ。细胞内新合成的

LC3其C端被Atg4蛋白酶剪切，成为胞质可溶形式的LC3-Ⅰ。当

自噬体形成后，LC3-Ⅰ经剪切和泛素化加工修饰。与自噬体膜表面的

磷脂酰乙醇胺(PE)偶联，成为膜结合形式的LC3-Ⅱ并定位于自噬体

内膜和外膜,因此LC3-Ⅱ/Ⅰ比值的大小可以估计自噬水平的高低。

2）细胞自噬底物蛋白的检测

p62偶联于LC3，作为一种调节因子参与自噬体的构成，在自噬

的中、晚期被降解。细胞内整体p62水平的表达与自噬活性存在负

相关。蛋白质免疫印迹技术检测p62水平的降低可以反映自噬活性

程度。p62的增加暗示着自噬、溶酶体降解途径被抑制。

3）Atg12-Atg5复合体

除了LC3，自噬体膜上标志性蛋白质还有Atg12-Atg5结合体。

Atg12和Atg5在翻译后就像单个分子一样共价结合在一起，它定位

在自噬体双层隔离膜的整个延长阶段。

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