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实验一紫外分光光度法测定核酸的含量

一、实验目的

了解紫外分光光度计的基本原理和使用方法

学习使用紫外分光光度法测定核酸含量的原理和操作方法

二、实验原理

核酸、核苷酸及其衍生物都具有共轭双键系统，能吸收紫外光。RNA和DNA的紫外

吸收高峰在260nm波长处。遵照有色溶液对光吸收的物理定律即Lambert-Beer定律，可以

从紫外光吸收值的变化来测定核酸物质的含量。一般在260nm波长下，每毫升含1μgDNA

溶液的光吸收值为0.020，每毫升含1μgRNA溶液的光吸收值为0.022。故测定未知溶液在

260nm的光吸收值即可计算出其中核酸的含量。此法操作简便，迅速。

蛋白质和核苷酸等也有紫外吸收。通常蛋白质的吸收高峰在280nm波长处，在260nm

处吸收值仅为核酸的1/10或更低，因此对于含有微量蛋白质的核酸样品，测定误差较小。

RNA的260nm与280nm吸收比值在2.0以上；DNA的260nm和280nm吸收比值在1.9

左右，当样品中蛋白质含量较高时，比值下降。若样品中混有大量的蛋白质和核苷酸等紫外

吸收物质时，应设法除去。

三、实验器材

S54紫外分光光度计

操作指南：插上电源插头，打开仪器左侧面下方的电源开关，本仪器具备计算机自检

与波长及100％线自正功能，开机后显示窗两侧8灯全亮，指示灯进入自检与自校状态，约

需10多分钟。当TRANS灯亮即说明自校结束进入待机状态，可随时应用。设定波长（本

实验波长为260nm和280nm），按λPara键到λNow灯亮，按▲或▼至要求波长，再按λPara

确认，显示窗改变波长至设定值。推开比色室的盖子。将空白和样品溶液分别仔细倒入特殊

的石英比色皿中（倒入之前先用少量溶液润洗比色皿一次），用擦镜纸擦去比色皿表面的余

液，然后将比色皿插入比色室里的卡座中，拉动卡座拉杆，将空白液的比色皿置于光路中。

按MODE键，使TRANS.透射比键灯亮，在比色室盖子关闭的状态下按一下0％T键，使显

示窗中的数字为0.000。关闭比色室的盖子，按一下100％ABS，使显示窗中的数字为100.0。

这样仪器就调整好了。再按MODE键，使ABS灯亮，拉动卡座拉杆，使样品液的比色皿置

于光路中，此时，显示窗中的数字即为样品的吸光度。将结果记录下来。将比色皿中的溶液

倒入废缸中，用洗液洗净比色皿。注意：不测定时，请将比色室的盖子打开。测定时必须保

持比色室干燥干净，严禁将溶液洒落比色室。且手只能接触比色皿的毛面。

其它器材：移液管、洗耳球、试管、试管架、烧杯、擦镜纸等。

四、实验试剂

标准RNA溶液：100μg/ml

待测的RNA溶液

五、操作方法

1、标准曲线的制作：取7只试管、2只移液管（分别为1ml和5ml）按照下表加样。

试管1234567

标准RNA溶液（ml）00.10.20.40.60.81

1

蒸馏水（ml）54.94.84.64.44.24.0

混匀后以1号管为空白，在260nm处测定光吸收值A，以溶液的浓度为横坐标、A值

为纵坐标，在坐标纸上绘制出标准曲线，理论上它应该是一条直线。

2、样品的测定

用试管取6ml左右待测的RNA溶液，仍以1号试管为空白，分别在260nm和280nm

处测定光吸收值A，用A260在标准曲线上查出待测的RNA溶液的浓度。并计算A260/A280，

此值大于2.0，表示待测的RNA样品很纯。

六、思考题

1.在绘制标准曲线中，如何保证曲线的精度及准确度？如果待测样品的RNA浓度超过