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实验七细菌的药敏试验及耐药性检测

【目的和要求】

1.掌握纸片扩散法（K-B法）、液体稀释法两种药敏试验的原理和方法。

2.熟悉上述两种药敏试验方法的应用。

3.了解几种细菌耐药表型检测的原理、方法及意义。

【试剂与器材】

1．培养基：一般需氧和兼性厌氧菌采用水解酪蛋白（M-H）琼脂或M-H液体培养基

（pH7.2~7.4）。对于营养要求高的细菌，则需在M-H培养基中加入其它营养成分。

2．抗菌药物纸片：直径为6.0~6.35mm的滤纸片上，含有一定量的某种抗菌药物。市

场有售，但生产厂家须获得国家食品药品监督管理局（SFDA）批准。不同种类的待测菌药敏

试验选择不同的抗菌药物，药敏纸片的选择见表7-1。

3．待测细菌接种普通营养琼脂经35℃16~18h的纯培养物。

4.0.5%麦氏比浊管配制方法如下：

0.048molBaCl(1.17%W/VBaCl.2HO)0.5ml

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0.18molHSO(1%,V/V)99.5ml

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将二液置冰水浴中冷却后混合，置螺口试管中，放室温暗处保存。用前混匀。有效期

为6个月。

5.其它：无菌生理盐水、无菌棉签、无菌试管、酒精灯、镊子、生物安全柜、培养箱

等。

【实验内容】

一、纸片扩散法（K-B法）药敏试验

1．原理

将含有定量的抗菌药物纸片贴在已接种待测细菌的琼脂平板表面，纸片上的药物随即溶

于琼脂中，并沿纸片周围由高浓度向低浓度扩散，形成逐渐减少的梯度浓度。在纸片周围，

一定浓度的药物抑制了细菌的生长从而形成了透明的抑菌环，抑菌环的大小则反映了待测菌

对该种药物的敏感程度。

K-B法是由Kirby-Bauer建立，美国NCCLS推荐，目前为世界所公认的标准纸片扩散

法（定性法）。

2．方法

（1）培养基的准备：将无菌M-H琼脂加热融化，趁热倾注入无菌的直径90mm平皿中。

琼脂厚为4mm（约23~25ml培养基），琼脂凝固后塑料包装放4℃保存，在5日内用完，使用

前应在37℃培养箱放置30min使表面干燥。

（2）试验菌液准备：将待测细菌接种于普通琼脂平板，35℃培养16~18h，然后从平板

上挑取数个菌落，于2~3ml无菌生理盐水中混匀后与0.5麦氏比浊管比浊，调整浊度与标准

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比浊管相同，其细菌浓度相当于10CFU/ml。

（3）细菌接种：用无菌棉拭蘸取已调试的菌液，在管壁上稍加挤压之后，手持棉拭于

M-H琼脂表面均匀划线接种，共划3次，每次将平板旋转60°角，最后沿平板内缘涂抹一周，

盖上平板，室温下置3~5min待琼脂表面的水分稍干。

（4）贴纸片用无菌镊子夹取药物纸片平贴在种好细菌的琼脂表面，每个平板可贴4~6

种药物纸片。纸片放置要均匀，各纸片中心距离不小于24mm，纸片距平板边缘的距离应不

小于15mm。纸片一旦接触琼脂表面，就不能再移动。

（5）培养：贴好药物纸片的平板应于室温下放置15min，然后翻转平板，放35℃培养

18~24h之后观察结果。

3．结果观察和报告

将平板置于黑背景的明亮处，用卡尺从背面精确测量包括纸片直径在内的抑菌环直径，

测得结果以毫米为单位进行记录，最后参照NCCLS的标准（见附录）进行结果判断，并以敏

感（sensitivity）、中度敏感（morderatesensitivity）和耐药（resistant）等程度报告

之。

4．注意事项

（1）培养基的成分、酸碱度以及平板的厚度等对试验结果都可以造成影响。购买培养

基时应考虑其质量，对每批M-H琼脂平板均需用标准菌株检测，合格后方可使用。制备平板

时，注意其厚度并且厚薄要均匀。

（2）药物纸片的贴放要均匀，并且要充分接触琼脂。药物纸片应始终保存在封闭、冷

冻、干燥的环境，否则会影响其活性。长期储存须置-20℃的冰箱，日常使用或没用完的纸

片应及时放4℃保存，用时须提前1~2h取出放室温平衡。纸片应在有效期内使用。