自建HBV-DNA实时荧光定量PCR检测系统性能验证方法及结果分析.pdf

自建HBV-DNA实时荧光定量PCR检测系统性能验证方法

及结果分析

辛娜;杨超;白跳艳;王永锋;康炜

【摘要】目的探讨自建乙型肝炎病毒核酸(HBV-DNA)实时荧光定量PCR检测系

统性能验证的方法和程序,充分了解其检测性能,评估并确认分析性能是否符合预期

用途.方法参考美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)颁布的EP系列文件及中国

合格评定国家认可委员会(CNAS)对实验室检测系统评估的要求,对实验室自建的

HBV-DNA实时荧光定量PCR检测系统进行精密度、正确度、线性范围、检测下

限等性能参数的验证和评价.结果HBV-DNA定量检测低值和高值的批内精密度

CV分别为3.4％和1.8％,总精密度CV分别为3.8％和1.8％.正确度初次验证有两

项不符合要求,经厂家校准后重新验证符合要求.线性回归方程为y=0.997X

+0.012,R2=0.999,线性范围为500-108IU/ml.检测下限为500IU/ml.结论自建

HBV-DNA实时荧光定量PCR检测系统的性能符合要求,能够应用于临床检测.

【期刊名称】《山西医科大学学报》

【年(卷),期】2016(047)004

【总页数】5页(P365-369)

【关键词】HBV-DNA;实时荧光定量PCR;检测系统;性能验证

【作者】辛娜;杨超;白跳艳;王永锋;康炜

【作者单位】西安医学院第一附属医院检验科,西安710077;西安医学院第一附属

医院检验科,西安710077;西安医学院第一附属医院检验科,西安710077;西安医学

院第一附属医院检验科,西安710077;西安医学院第一附属医院检验科,西安

710077

【正文语种】中文

【中图分类】R446

近年来，临床实验室质量保证的概念逐步地进入我们的临床检验实践，临床检验已

经进入到一个规范化和标准化的时代，ISO15189和CAP认可要求中明确指出临

床实验室在开展某一检测项目前需进行方法学认证，充分了解其检测性能，评估并

确认分析性能是否符合预期用途。有专家指出不同的检测项目和检测系统需选择不

同的方法学验证程序［1］。实时荧光定量PCR检测涉及多个环节，程序繁琐，

手工操作步骤多，性能评价的实验设计及数据分析相比生化、免疫、临检等领域尚

无权威机构发布的成熟方法。本研究参考美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）

颁布的EP系列文件及中国合格评定国家认可委员会（CNAS）《医学实验室质量

和能力认可准则在基因扩增检验领域的应用说明》，对实验室自建的HBV-DNA

实时荧光定量PCR检测系统进行精密度、正确度、线性范围、检测下限等性能参

数的验证和评价，现报道如下。

1.1材料

HBV-DNA工作标准品来自配套试剂盒，HBVDNA高值和低值标本来自本科室收

集的临床标本，阴性血清为临床乙肝三系全阴性标本。所有标本均为无溶血、脂血

等富含大量PCR抑制物的标本，分离血清后当天收集并于-20℃保存备用。

1.2仪器

RocheLightCycler1.5荧光定量PCR仪，科大创新HC-2518高速离心机，杭州

奥盛K30B干式恒温金属浴，上海FINNPIPITTE0.2-10μl，5-50μl，20-200μl移

液器。所有分析设备和辅助设备均在校准效期内。

1.3试剂

采用上海科华生物工程股份有限公司提供的有效期内乙型肝炎病毒核酸定量检测试

剂盒（批号:）。

1.4人员

由具有检验医学职业资质且取得PCR上岗证的操作人员严格按照SOP文件操作。

1.5方法

1.5.1精密度评价参照EP15-A2文件［2］，取HBV-DNA低值和高值2个水平

样本，每天分析一个批次，每个水平重复测定4次，连续检测5d，每个水平累计

得到20个数据，参照文献［3］计算批内精密度变异系数（CV批内）和总精密度

（CV总）。以能力验证/室间质评评价界限（靶值±0.4对数值）作为允许总误差

（TEa），重复性精密度＜3/5TEa，中间精密度小于＜4/5TEa为符合要求。

1.5.2正确度评价测定试剂盒配套标准品（批号）共4个浓度水平，

分别测3次取均值，分别计算偏倚，根据ISO15189对性能参数的相关要求，以

允许偏倚≤1/3室间质评允许总