DB21T 2323-2014 亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒RT-PCR检测方法.docxVIP

ICS11.220B41

DB21

辽宁省地方标准

DB21/T2323—2014

亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒RT-PCR检测方法

MethodofRT-PCRforthedetectionoftypeAsia1footandmouthdiseasevirus

2014-07-05发布2014-09-05实施

辽宁省质量技术监督局发布

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DB21/T2323—2014

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由辽宁省动物疫病预防控制中心提出。本标准由辽宁省畜牧兽医局归口。

本标准起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省动物医学研究院。

本标准主要起草人：杨本勇、曹东、李井春、王宏燕、李树博、段亚良、刘坤洋、何利昆、王军、丁静、张鑫、王芬、王海波

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DB21/T2323—2014

亚洲I型口蹄疫病毒RT-PCR检测方法

1范围

本标准规定了亚洲I型口蹄疫病毒（FMDV-AsiaI）RT-PCR检测方法的实验材料、仪器设备、试剂、操作步骤和结果判定，并介绍了其原理。

本标准适用于动物及动物产品中亚洲I型口蹄疫病毒的检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

分析实验室用水规格和试验方法

兽医实验室生物安全技术管理规范

3缩略语

下列缩略语适用于本标准。

DEPC（diethypyocarbonate）

焦炭酸二乙酯

RNA(ribonucleicacid)

核糖核酸

RT-PCR(reversetranscription-PCR)

反转录聚合酶链反应

dNTP(deoxy-ribonucleosidetriphosphate)

脱氧核苷酸三磷酸

bp(basepair)

碱基对

O-P液(oesophagus-pharyngeal)

牛、羊食道-咽部分泌物

EB（Ethidiumbromide）

溴化乙锭

FMDV-AsiaI（Foot-and-mouthdiseasevirusserotypeAsiaI）

亚洲I型口蹄疫病毒

4原理

FMDV是一种RNA病毒。RNA反转录产生的cDNA可作为PCR模板进行扩增。根据FMDV-AsiaI保守基因序列设计一对引物，在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以引物为延伸起点，通过变性、退火和延伸，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA。

5实验材料、仪器设备和试剂

5.1实验材料

眼科剪、眼科镊、称量纸、1.5mL灭菌离心管（经DEPC水处理）、0.2mL薄壁PCR管、500mL量筒、

500mL三角瓶、吸头（10μL、200μL、1000μL）。

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DB21/T2323—2014

5.2仪器设备

分析天平、低温高速离心机、PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪（或紫外分析仪）、-70℃冰箱、微波炉、组织研磨器、-20℃冰箱、可调移液器（最大量程分别为2μL、20μL、200μL、1000μL）。

5.3试剂

5.3.12.5mmol/LdNTP。

5.3.2引物：上游引物5′-GCGCTCGTCCACACAGGACCGG-3′,下游引物5′-CATGTCCTCTTGCATCTGGTT-3′。

5.3.310倍PCR缓冲液。

5.3.41%溴化乙锭（EB）溶液（见第A.1）。

5.3.5电泳缓冲液（50倍）（见第A.2）。

5.3.61%琼脂糖凝胶（见第A.3）。

5.3.775%乙醇（见第A.4）。

5.3.8灭菌DEPC水（见第A.5）。

5.3.9上样缓冲液(见第A.6)。

5.3.10电泳缓冲液（1倍）（见第A.7）。

5.3.11磷酸盐缓冲液（0.04mol/L、pH7.4）（见第A.8）。

5.3.12其他试剂：10U/μLAMV反转录酶、50U/μLRNA酶抑制剂、5U/μLTaqDNA聚合酶、异丙醇、25mmol/L氯化镁溶液。

注：除另有规定，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682-2008的灭菌双蒸水或超纯水。

6操作步骤

6.1样品的采集、保存运送和处理

6.1.1样品采集

6.1.1.1水泡液：未破