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实时荧光定量pcr实验报告

篇一：实时荧光定量PCR方式简介

实时荧光定量PCR方式简介

一．实时荧光定量PCR的大体原理

理论上，PCR进程是依照2n（n代表PCR循环的次数）指数的方式进行模板的扩增。但在实际的PCR反映进程中，随着反映的进行由于体系中各成份的消耗（主若是由于聚合酶活力的衰减）使得靶序列并非按指数方式扩增，而是按线性的方式增加进入平台期。因此在起始模板量与终点的荧光信号强度间没有靠得住的相关性。如采纳常规的终点检测法（利用EB染色来判定扩增产物的多少，从而间接的判定起始拷贝量），即便起始模板量相同经PCR扩增、EB染色后也完全有可能取得不同的终点荧光信号强度。

为了能准确判定样品中某基因转录产物（mRNA）的起始拷贝数，实时荧光定量PCR采纳新的参数——Ct值，定量的全然原理是Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系。

Ct值是如何取得的

在实时荧光定量PCR的进程中，靶序列的扩增与荧光信号的检测同时进行，定量PCR仪全程搜集荧光信号，实验终止后分析软件自动按数学算法扣除荧光本底信号并设定阈值从而取得每一个样品的Ct值。

Ct值的概念

Ct值中的“C”代表Cycle（循环），“t”代表检测threshhold（阈值），其含义是PCR扩增进程中荧光信号强度达到阈值所需要的循环数；也能够明白得为扩增曲线与阈值线交点所对

应的横坐标。

Ct值与样品中模板的对应关系

Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系（y=ax+b，x代表起始模板拷贝数的对数，y代表Ct值）。

与终点法相较利用Ct值的优势

由于Ct值是反映实际PCR反映进程中扩增即将进入指数期的参数，该参数几乎不受试剂消耗等因素的阻碍，因此利用Ct值判定的起始模板拷贝数加倍精准，重复性也更好。传统的终点检测法是在PCR扩增经历了指数扩增期进入平台期后利用EB等染料染色来判定扩增产物的多少，从而间接的判定起始拷贝量，这种方式的精准度不高、重复性也不行。以下图中是96个复孔的实时扩增曲线（完全相同的反映体系、相同的反映protocol、相同的样品起始浓度），能够看到Ct值具有专门好的重复性，而终点的荧光信号强度不同达到300个单位。

另外，采纳实时荧光定量PCR还能从方式学上有效的避免PCR实验中交叉污染的问题。因为荧光定量PCR中模板的扩增与检测是同时进行的，当实验完成后即可取得定量结果，

直接抛弃含有大量扩增产物的反映管，完全幸免了传统方式中掏出扩增产物进行电泳鉴按时扩增产物对实验室造成二次污染的可能性。

二．荧光定量PCR的2类方式（按荧光产生的原理分类）染料法（SYBRGreen法）

染料法即利用SYBRGreen分子产生的荧光信号来进行样品定量。该方式与常规的PCR类似，唯一的区别是在反映体系中加入了SYBRGreen染料分子。该染料分子的激发波长为497nm，发射波长为520nm。与EB的性能类似，SYBRGreen也是一种扁平状的分子，处于游离状态时具有很低的荧光本底，当反映体系中存在dsDNA时，SYBRGreen能特异性的与之结归并在497nm激发下。

染料法的优势：1，无需设计、合成探针，实验本钱低；2，利用方便，与常规PCR的操作几乎相同。

染料法的缺点：1，由于SYBR

Green与dsDNA的结合只具有结构特异性而不具有序列特异性，除与特异性的靶序列扩增产物结合外，还能与在PCR扩增进程中形成的引物二聚体、非特异性扩增产物结合，从而造成扩增效率的降低、结果的不准确。因此采纳该方式关于引物的设计及实验条件的优化要求很高，确保反映进程中没有非特异性产物的扩增；2，由于SYBRGreen的上述特点，该方式不能应用于MultiplexQPCR技术。（在一个反映管中同时检测多个目的基因的表达情形）

探针法（以TaqMan探针为例）

探针法荧光定量PCR与常规PCR的不同的地方在于：在上、下游引物外还加入了具有序列特异性的探针（探针本身具有荧光标记），该探针依照需要扩增的靶序列设计因此只能与待检测序列结合，与染料法相较提高了实验的特异性。目前市场上的探针要紧种类有：TaqMan、MolecularBeacon、Scorpions、Hybirdization等，其中以TaqMan探针应用最普遍。TaqMan探针的结构：长度与一般PCR引物类似，大约20bp左右。在5’与3’端各标记有一个荧光基团，5’的荧光基团称为报告基团（Report），3’的荧光基团称为淬灭基团（Quencher）。

TaqMan探针的性能：在探针结构完整的情形下用特定的波长激发报告基团，由于报告基团与淬灭基团的空间位置很近，因此报告基团能