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勿以恶小而为之,勿以善小而不为。——刘备
细胞凋亡流式检测对流式管路的影响分析
工作原理:
正常细胞的表面由不对称分布在质膜内叶和外叶上的脂质组成。
这些脂质之一磷脂酰丝氨酸(PS),通常仅分布于质膜的内叶,因此
仅暴露于细胞质中。然而,在细胞凋亡过程中,脂质不对称性消失并
且PS暴露在质膜的外部小叶上。AnnexinV是一种36kDa的钙依
赖性的磷脂结合蛋白,能够与PS结合。因此,荧光标记的AnnexinV
可用于检测暴露于早期凋亡细胞外部的PS。AnnexinV还可以染坏死
细胞,因为这些细胞的膜破裂,使AnnexinV可以进入整个质膜,但
是AnnexinV就无法区分坏细胞死(中晚期凋亡细胞)和早期凋亡细
胞。因此,通过与碘化丙啶(PI)共染色,可以将凋亡细胞与坏死细
胞(中晚期凋亡细胞)区分开,因为早期凋亡细胞和活细胞的细胞膜
仍然完整,PI能进入坏死细胞(中晚期凋亡细胞)但是被早期凋亡
细胞排除在外。该方案描述通过AnnexinV结合和PI摄取,然后通
过流式细胞仪检测和量化凋亡细胞。
AnnexinV/PI染色方法:
1)根据细胞类型,选择合适的细胞板接种培养目的细胞;
2)用细胞毒性刺激物处理细胞或通过紫外线辐射触发贴壁细胞
死亡,使用明场显微镜观察细胞;
3)收集细胞,将1×105个细胞重悬于200μLBindingBuffer
中,加入4μL0.5mg/mLPI和2μLAnnexinV-FITC溶液;
4)避光室温孵育15min;
勿以恶小而为之,勿以善小而不为。——刘备
5)用流式细胞仪进行荧光检测。(AnnexinV-FITC最大激发光
为488nm,发射光为520nm。PI最大激发光为~535nm,发射光为
617nm。但是,两者都可以被488nm激光激发。)
流式细胞术检测:
通过AnnexinV结合和PI摄取来测量细胞死亡。(A)以漫画形
式描述凋亡细胞AnnexinV结合和PI摄取。(i)磷脂酰丝氨酸(PS)
位于活细胞完整质膜的内部小叶上,这些细胞不会被AnnexinV和
PI染色。(ii)PS翻转到凋亡细胞质膜的外部小叶,这些细胞在外
部结合AnnexinV,但仍不被PI染色。(iii)继发性坏死细胞(中
晚期凋亡细胞)膜破裂,AnnexinV与质膜上的PS结合,PI被吸收
并与DNA结合。(B)在流式数据的点图中(左侧)以及在用放线菌
素D(1μM)处理16h并用AnnexinV染色的U937细胞的点图中观
察到i,ii和iii中的种群的地方AnnexinV-FITC和PI(右侧)。
实验过程中的小建议(大作用):
1)要准备阴性对照(不加染料)、阳性对照(同时加两种染料)
和单染样品(分别只加一种染料),阳性对照和单染样品细胞可以
55℃水浴10min或用凋亡诱导剂诱导细胞凋亡。
2)细胞凋亡检测的是活细胞,切勿用甲醛固定,尽量避免酶消
化时间过长或用力吹打产生细胞碎片,重悬细胞后尽快上机检测。
3)AnnexinV的结合依赖于钙离子,所以消化液中避免含有EDTA,
否则会影响AnnexinV与PS的结合。
4)AnnexinV的结合不稳定,所以需要在标记时确保使用含钙
勿以恶小而为之,勿以善小而不为。—
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