流感病毒实验室检测.pptVIP

鸡胚分离方法-试剂准备1)?????9～11日龄鸡胚2)?????照蛋灯3)?????70%～75％酒精4)?????1ml一次性注射器5)?????鸡蛋开孔器6)?????无菌胶布或蜡7)?????10ml试管和试管架8)?????10ml移液管或1ml移液器及无菌吸尖9)?????无菌镊子10)无菌眼科剪鸡胚分离方法-标记鸡胚■检视标记鸡胚◆用照蛋灯检视鸡胚，判断鸡胚状态血管：活胚血管清晰；死胚模糊，成淤血带或淤血块胎动：活胚有明显的自然运动，死胚无胎动绒毛尿囊膜发育界限：密布血管的绒毛尿囊膜与鸡胚胎的另一面形成明显的界限◆标记出鸡胚的气室与尿囊的界限、胚胎头部的位置◆如果鸡胚是死胚、没有受精、有裂痕、发育不全、或表面有好多渗水孔，应弃掉鸡胚分离方法接种病毒方法01单腔接种盲种双腔接种灯下接种开窗接种02从窗口中滴入无菌的液体石蜡，然后轻轻晃动鸡胚，让液体石蜡在鸡胚壳膜内层铺开，此时在照蛋灯下即可清楚的看到鸡胚胎的位置。将注射针头刺入胚胎的鄂下胸前，用针头轻轻拨动下颚及腿，当进入羊膜腔时，能看到鸡胚随着针头的拨动而动，即可注射100μl标本。将针头退出至?寸，将另外100μl标本注入鸡胚尿囊腔04用注射器吸200μl处理过的临床标本，装上16号针头03将标记好的鸡胚的气室朝上放置在蛋盘上，通常每个样本接种3个鸡胚01用70%～75％酒精消毒鸡胚，在气室端钻孔，开10x6mm窗口02鸡胚分离流程（1）用同一注射器和针头将同一标本依上法接种另外的两枚鸡胚将针头弃于合适的生物安全装置中用消毒过的医用胶布封口33～35oC温箱培养鸡胚2～3天。临床采样标本通常培养3天，病毒传代通常培养2天鸡胚进行病毒分离培养时，每天检查鸡胚生长情况，24小时内死亡的鸡胚，认为是非特异死亡应弃去鸡胚分离流程（2）鸡胚在收获前应4℃过夜或至少放置4小时01标记15ml无菌塑料管与相应的鸡胚编号一致02用70%～75％酒精消毒鸡胚顶部03用无菌镊子撕破鸡胚气室蛋壳，推开鸡胚尿囊膜。用10ml吸管吸取鸡胚尿囊液置于相应的收集管中。用吸管刺破鸡胚羊膜，尽量吸取羊水放置于另外的管中。羊水较少时也可以将3个鸡胚的羊水合并04收获尿囊液和羊水鸡胚分离流程（3）鸡胚病毒鉴定经HA试验阴性者，将羊水和尿囊液混合，继续盲传1代（72小时），如仍为阴性，则鸡胚病毒分离为阴性，标本可弃去鸡胚收获HA试验红细胞凝集抑制试验红细胞凝集病毒鉴定红细胞凝集试验4个凝集单位配制“回滴”红细胞凝集抑制试验判定流感病毒型别病毒鉴定流程MDCK细胞或鸡胚收获的标本分离物首先用鸡、豚鼠或人红细胞进行红细胞凝集试验（HA），确定病毒滴度A原理：流感病毒颗粒表面的血凝素蛋白（HA）含有能结合并识别红细胞表面含唾液酸的糖蛋白或脂蛋白结构，许多哺乳动物和禽的红细胞表面均含有这两种成分。因此流感病毒能与其结合并识别，产生凝集现象。当血清中有特异性抗体与病毒血凝素结合后，可以抑制凝集现象出现B红细胞凝集试验（HA）红细胞鸡火鸡豚鼠人O型血红细胞马适用范围流感和禽流感病毒流感和禽流感病毒流感病毒流感病毒禽流感病毒终浓度（％）0.5（1%）0.5（1%）0.75（1.5%）/0.5（1%）0.75（1.5%）/0.5（1%）0.5（1%）孔底部形状U或V型U或V型U型U型U型孵育时间30min30min45min45min60min细胞对照细胞沉积成圆点状，倾斜时细胞向下流成泪滴状细胞沉积成圆点状，倾斜时细胞向下流成泪滴状细胞沉积成环状细胞沉积成环状细胞沉积成环状AHBCDEFG100ul病毒液50ul50ul50ul50ul50ul50ul50ul50ul50ul50ul50ul50ul稀释完病毒液后加入50ul红细胞悬液50ulPBS病毒原液1：21：128HA：32HA＞128HA：4若传1～2代后，HA滴度仍8者，可应用核酸检测方法进行鉴定HA滴度≥8，进行红细胞凝集抑制（HI）试验；HA滴度8者，继续在敏感的MDCK细胞系或鸡胚上进行传代培养，使其HA滴度≥8后，再进行HI测定0201红细胞凝集试验（HA）红细胞凝集抑制（HI）试验HA试验完成后，用国家流感中心每年提供的抗A（H1N1）、抗A（H3N2）、抗B（Victoria系）和抗B（Y