现代免疫学技术.ppt

胶体金标记胶体金是氯金酸(HAuCl4)的水溶胶颗粒，如同铁蛋白一样具有高电子密度，在电镜比铁蛋白颗粒更致密，易于辨认，定位比酶反应物精确。胶体金容易和多种大分子物质、包括抗体、A蛋白、凝集素等结合。根据制备方法不同，可以得到直径在3—150nm之间的各种大小的胶体金颗粒；分别使用不同直径的胶体金颗粒制备标记物，可以在同一标本片上显示两种或多种抗原物质，即所谓双标记或多标记。胶体金标记物还可代替铁蛋白作为扫描免疫电镜的标记物。因此，胶体金成为当前免疫电镜工作者最感兴趣的标记物。第32页,共46页，星期六，2024年，5月胶体金标记第33页,共46页，星期六，2024年，5月七、胶体金试纸条技术胶体金标记技术(Immunogoldlabelingtechnique)是以胶体金作为示踪标记物，应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术.胶体金是由氯金酸在还原剂等作用下，聚合成特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，故称为胶体金。利用它在碱性环境中带负电荷的性质，与蛋白质分子的正电荷基团相互吸引而形成牢固结合，除抗体蛋白外，胶体金还可与其他多种生物大分子结合。第34页,共46页，星期六，2024年，5月胶体金标记试纸条第35页,共46页，星期六，2024年，5月胶体金标记试纸条第36页,共46页，星期六，2024年，5月八、免疫PCR技术(Immuno-PCR)免疫PCR是一种抗原检测系统，将一段已知序列的DNA片段标记到抗原抗体复合物上，再用PCR方法将这段DNA扩增，然后用常规方法检测PCR产物。免疫PCR集PCR的高灵敏度与抗体和抗原反应的特异性于一体。其突出的特点是指数级的扩增效率带来了极高的敏感度，能检出浓度低至2ng/Ｌ的抗原物质，为现行任何一种免疫定量方法所不及。第37页,共46页，星期六，2024年，5月免疫PCR体系的组成免疫PCR体系由待检抗原,特异性抗体,连接分子，DNA和PCR扩增系统。待检的抗原可以直接吸附于固相(包被抗原)，这一过程与ELISA试验是相同的。免疫PCR中的特异性是对应于待测抗原，与ELISA一样，抗体的特异性和亲和力将影响免疫PCR的特异性和敏感性。一般均选用单克隆抗体，这个抗体常采用生物素标记，通过亲和或叶绿素再结合DNA。第38页,共46页，星期六，2024年，5月特异抗体与DNA之间的连接连接分子?连接分子是连接特异抗体与DNA之间的分子。Sano等用链亲和素/蛋白Ａ(striptavidin-proteinA)基因工程融合体作为连接分子来连接生物素标记的DNA与抗体，此种融合蛋白的链亲和素部分可识别DNA上的生物素，蛋白部分可识别抗体的Fc段。

第39页,共46页，星期六，2024年，5月DNA和PCR系统免疫PCR中的DNA是一指示分子，用DNA聚合酶将结合于固相上的DNA特异放大，由此定量检测抗原。免疫PCR的敏感性多于ELISA主要是应用了PCR强大的扩增能力。免疫PCR中的DNA分子可以选择任何DNA，但要保证DNA的纯度，且有较好的均质性，尽可能不选用受检样品中可能存在的DNA。DNA的生物素化是用生物素标记的dATP或dUTP通过聚合酶标记在DNA分子上，一般是1个分子DNA标记2个生物素，标记率可达百分之百。免疫PCR的PCR扩增系统与一般PCR一样,主要包括引物、缓冲液和耐热DNA聚合酶。

第40页,共46页，星期六，2024年，5月免疫PCR产物的检测?PCR扩增产物一般先用琼脂糖凝胶进行电泳，然后经嗅化乙啶染色，再照相记录PCR产物的电泳结果，通过底片上PCR产物的光密度可以得出PCR产物的量，即代表固相上吸附的待检抗原量，将其与标准抗原制备的标准曲线进行比较就可以准确地得出抗原的实际量。第41页,共46页，星期六，2024年，5月九、蛋白质相互作用的免疫学研究方法蛋白质相互作用的类型有牢固型互作和暂时型互作两种。互作力既可以强，也可以弱。牢固型互作以多亚基蛋白复合体常见，可以通过免疫共沉淀（Co-IP）、Pull-down或Far-western法研究。暂时型蛋白质相互作用，被认为是涉及到胞内大部分生物过程，包括蛋白修饰、转运、折叠、信号转导和细胞周期等，属于开/闭性质，可以通过交联或标记转移法来研究。胞内研究蛋白质互作的方法除上述方法外，还有蛋白芯片、核磁共振、质谱、X-射线晶体衍射等。PIERCE在相关试剂（包括芯片）等方面都有专利产品第42页,共46页，星期六，2024年，5月免疫沉淀

（immnolprecipitation，IP)免疫沉淀反应是指可溶性抗原与相应抗体在有电解质存在的情况下，按适当比例所形成的可见沉淀