琼脂糖凝胶电泳的操作步骤.pdf

子曰:“知者不惑，仁者不忧，勇者不惧。”——《论语》

琼脂糖凝胶电泳的操作步骤

琼脂糖凝胶电泳的操作步骤如下：

1.制备1%琼脂糖凝胶(大胶用70ml,小胶用50ml):称取0.7

g(0.5g)琼脂糖置于锥形瓶中,加入70ml(50ml)1×TAE,瓶口倒扣小

烧杯.微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化,摇匀,即成1.0%琼脂糖凝

胶液.

2.胶板制备:取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净,晾干,放入

制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好,形成模子.将内

槽置于水平位置,并在固定位置放好梳子.将冷却到65℃左右的琼脂糖

凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板

表面形成均匀胶层.室温下静置直至凝胶完全凝固,垂直轻拔梳子,取下

胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中.添加

1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止.

3.加样:在点样板或parafilm上混合DNA样品和上样缓冲液,上

样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X.用10ul微量移液器分别将样品

加入胶板的样品小槽内,每加完一个样品,应更换一个加样头,以防污染,

加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面.(注意:加样前要先记下加样的顺序).

4.电泳:加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压60-100V,样品由

负极(黑色)向正极(红色)方向移动.电压升高,琼脂糖凝胶的有效分离范

围降低.当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时,停止电泳.

(5)电泳完毕后,取出凝胶,用含有0.5ug/ml的溴化乙锭1×TAE溶

液染色约20min,再用清水漂洗10min.

(6)观察照相:在紫外灯下观察,DNA存在则显示出红色荧光条带,

采用凝胶成像系统拍照保存

实验原理

闭合环状质粒、线性质粒和开环质粒DNA由于构形不同，在加溴

化乙锭的琼脂糖凝胶电泳上呈现不同的迁移率，因而在紫外灯下观察，

子曰:“知者不惑，仁者不忧，勇者不惧。”——《论语》

能区别闭合环状质粒DNA（cccDNA）、线性质粒DNA（L-DNA）

和开环质粒DNA（ocDNA）。

实验材料和试剂

（一）实验样品

质粒pUC118

（二）试剂

1．lDNA/HindIII分子量标准

2．溴酚蓝指示剂点样缓冲液

0.2%溴酚蓝

50%蔗糖

3．1mg/ml溴化乙锭溶液

4．电泳缓冲液（TAE）

40mmol/LTris-乙酸

1mol/LEDTA

(配制方法：24.2克Tris碱，5.71ml冰乙酸，10ml0.5mol/L

EDTA(pH8.0)，定容至5000ml）

5．0.7%琼脂糖凝胶

（配制方法：称取琼脂糖0.35克，加入50ml