临床PCR检验标本的处理保存及核酸提取方法.pptVIP

血红蛋白和乳铁蛋白分别是红细胞和白细胞内的主要PCR抑制物,它们均含有铁。抑制机制可能是：（1）与这些蛋白释放铁离子至PCR混合物中有关。研究铁的抑制效应时，发现其干扰DNA合成，而且胆红素、胆盐和氯化高铁血红素（Hemin）等血红蛋白衍生物，也是PCR抑制物。（2）亚铁血红素(Heme)可通过返馈抑制调节DNA聚合酶活性及协调红细胞内血红蛋白成分的合成。也观察到，氯化高铁血红素通过直接作用于DNA聚合酶，与成为一个与靶DNA竞争的抑制剂和核苷酸的非竞争性抑制剂。（3）由于靶核酸DNA被血液中大量的凝血有机物质包裹所致，使得靶DNA不能接触DNA聚合酶。0102血红蛋白、乳铁蛋白（lactoferrin）01021%(V/V)血液可完全抑制Taq酶活性，与Mg2+浓度无关。Tth聚合酶在含4%（V/V）血液的PCR反应混合液中可以进行扩增，加入1U单链DNA结合蛋白——T4基因32蛋白(gp32)，Tth聚合酶在含8%（V/V）血液情况下，仍可扩增。因此，使用Tth聚合酶和gp32蛋白，可实现从临床标本不提取纯化核酸直接扩增靶DNA。不同的热稳定的DNA聚合酶对临床标本中的抑制物的敏感性不一样。血红蛋白IgG的抑制作用是由于其与单链DNA的相互作用，使得靶DNA不能与DNA聚合酶相互作用1使用煮沸作为标本处理方法或使用PCR前的热启动,将增强IgG对PCR反应的抑制2IgG去除或减轻抑制的一些方法NaOH处理可中和临床标本中的TaqDNA聚合酶抑制剂，但这种方法不适用于DNA含量低的标本，因为NaOH处理可使DNA大量丢失。加入0.6%(wt/vol)牛血清白蛋白（BSA）可降低血液对TaqDNA聚合酶的抑制效应，既使在2%（vol/vol）血液存在下亦可成功扩增，而通常血液含量只能是0.2%。01BSA也可增加rTth或TaqDNA聚合酶的扩增能力，使其对粪便和肉类标本中抑制物的抵抗能力分别提高10和20倍。02单链DNA结合T4基因32蛋白（gp32）有类似BSA的增强效应。03去除或减轻抑制的一些方法核酸分离纯化技术起源于二十世纪五十年代，在七十年代和八十年代中传统的核酸沉淀溶解分离纯化方法得到了普遍的应用和推广。1传统的核酸提取方法常涉及去垢剂裂解、蛋白酶处理、有机溶剂提取及乙醇沉淀等步骤。2核酸纯化靶核酸可以与宿主细胞整合，核内游离及胞浆内各种构形存在于细胞内，如测定的是病原微生物,则靶核酸存在于细菌、病毒、原虫或真菌细胞内，如果上述细胞破裂,则靶核酸亦可存在于细胞外。一般均使用去垢剂(如Triton-100)裂解细胞，用一种蛋白裂解酶(如蛋白酶K)消化结合于核酸的蛋白质，从而将靶核酸从细胞内释放出来。一般核酸提取试剂促使靶核酸从细胞内释出的原理核酸的分离纯化就是要将蛋白、脂类等干扰核酸扩增的物质去除。01硅吸附法03经典方法02对于商品核酸提取试剂盒，临床实验室在使用前，必须对其核酸提取纯度和效率进行评价。04核酸的分离纯化DNA提取的经典方法即所谓的”酚-氯仿提取法”临床标本及实验室环境中,存在大量对RNA具有强烈降解作用的RNase，而RNase较耐高温,不易失活。010102如何避免RNase对标本的污染及防止RNase对提取的RNA的降解,是保证RNA成功提取的关键之所在。02RNA提取的独特性经高压灭菌的一次性使用的塑料制品如试管,离心管等基本上无RNase,可以不经预处理直接用于制备和贮存RNA.实验室用的普通玻璃器皿经常有RNase污染,使用前必须于180℃干烤8小时以上,或用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)的水溶液浸泡用于制备RNA的烧杯,试管和其它用品。DEPC是RNase的强烈抑制剂。灌满DEPC的器皿于37℃下放置2小时，然后用灭菌水淋洗数次，并于100℃干烤15分钟，最后高压蒸汽下15分钟。上述处理可除去器皿上痕量的DEPC,以防DEPC通过羧甲基化作用对RNA的嘌呤碱基进行修饰。RNA提取所用器皿的处理对于RNA提取所需溶液的配制,必须用高压灭菌的水和RNA研究专用的化学试剂配制溶液,用干烤过的药匙称取试剂,将溶液装入无RNase的玻璃器皿。可能的话,溶液均应用0.1%DEPC于37℃至少处理12小时,然后于100℃加热15分钟或高压蒸汽灭菌15分钟。须注意的是,DEPC可与胺类迅速发生化学反应,因此不能用来处理含有Tris一类的缓冲液,因此可存几瓶新的,未开封的Tris试剂以制备无RNase的溶液。RNA提取所用溶液的准备临床PCR检验标本的处理、

保存及核酸提取方法

卫生部临床检验中心李金明临床标本的正确采集、运送、保存