DB22_T 3366-2022 牛中华泰勒虫病检测 PCR法.docxVIP

ICS11.220CCSB41

DB22

吉林省地方标准DB22/T3366—2022

牛中华泰勒虫病检测PCR法

PCRdetectionoftheileriasinensisinbovine

2022-05-18发布2022-06-08实施

吉林省市场监督管理厅发布

I

DB22/T3366—2022

前言

本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规

定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由吉林省畜牧业管理局提出并归口。

本文件起草单位：延边大学、吉林省牧业信息中心、吉林省畜牧总站、长春市中小企业人才创业指导中心、延边朝鲜族自治州动物疫病预防控制中心、延边朝鲜族自治州畜牧总站。

本文件主要起草人：贾立军、柴方红、王欣睿、王全利、陈健、王海军、梁晚枫、薛书江、陆秀娟、肖玉海。

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DB22/T3366—2022

牛中华泰勒虫病检测PCR法

1范围

本文件规定了牛中华泰勒虫病PCR检测方法的试剂或材料、仪器设备、样品、试验步骤、结果判定和废弃物处理。

本文件适用于牛中华泰勒虫核酸检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求

NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。3.1

中华泰勒虫病theileriasinensis

中华泰勒虫(Theileriasinensis)寄生于牛的红细胞和白细胞中，以发热、贫血、黄疸及体表淋巴结肿大为典型症状的一种蜱传播性血液原虫病。

4试剂或材料

除另有规定，所用试剂均为分析纯，实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。

4.1试剂或材料

4.1.1血液DNA提取试剂盒。

4.1.2dNTP（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）。

4.1.3TaqDNA聚合酶。

4.1.4DNAMarker分子量标准。

4.1.550×TAE缓冲液见附录A.1。

4.1.6加样缓冲液见附录A.2。

4.1.710mg/mL溴化乙锭见附录A.3。

4.1.81%琼脂凝胶见附录A.4。

4.1.9阳性对照见附录A.5。

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DB22/T3366—2022

4.1.10阴性对照见附录A.6。

4.1.11质粒DNA制备见附录B。

4.1.12DNA凝胶回收试剂盒。

4.1.13质粒DNA提取试剂盒。4.2引物

PCR反应引物序列与浓度见表1。

表1PCR反应引物序列与浓度

引物

引物序列

参考序列

长度bp

浓度

pmol/μL

P1

5′-CACTGCTATGTTGTCCAAGAGATATT-3′

GenBan

（KX375400.1）

887

10

P2

5′-AATGCGCCTAAAGATAGTAGAAAAC-3′

5仪器设备

5.1PCR扩增仪，温度范围：4℃~100℃。5.2低温高速离心机，12000r/min以上。5.3高压灭菌器，120℃以上。

5.4恒温水浴锅，室温～100℃。5.5分析天平，感量0.1mg。

5.6水平电泳槽。

5.7电泳仪，电压1V～300V；电流1mA～400mA。5.8凝胶成像系统。

5.9微量移液器，单道2μL、10μL、20μL、100μL和200μL。

6样品

6.1采集

按照NY/T541规定采集牛抗凝全血，编号待处理。6.2处理

牛抗凝全血2000r/min离心5min，取沉淀待检。

7试验步骤

7.1模板制备

按血液基因组DNA提取试剂盒(4.1.1)操作说明书或等效方法提取模板DNA。7.2PCR反应

7.2.1反应体系

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DB22/T3366—2022

PCR反应体系见表2。

表2PCR检测反应体系

试剂

体积

10×ExTaq缓冲液

2.0μL

2.5mmol/LdNTP（4.1.2）