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海纳百川，有容乃大；壁立千仞，无欲则刚。——林则徐
实时荧光定量PCR（Real-TimePCR）实验流程
一、RNA的提取(详见RNA提取及反转录)
不同组织样本的RNA提取适用不同的提取方法，因为Real-TimePCR对RNA样品的质量要求
较高，所以，正式实验前要选择一款适合自己样品的提取方法，在实验过程中要防止RNA
的降解，保持RNA的完整性。
在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂；取2ug进行RNA的甲醛变性胶电泳检测，
如果存在DNA污染时，要用DNaseI进行消化（因为在处理过程中RNA极易降解，建议体
系中加入适量RNA酶抑制剂）。
二、DNaseI消化样品RNA中的DNA
用DNaseI消化DNA
组份加量
模板(RNA)10ug
RNaseInhibitor4ul
DNaseIbuffer10ul
DNaseI10ul
DEPC处理H2O至100ul
混匀，37℃90min
三、RNA琼脂糖凝胶电泳
1．1%的琼脂糖凝胶电泳凝胶的配制：
1）称取琼脂糖0.45g放入三角瓶中，向其中加入4.5ml的10×MOPS缓冲液和39.5ml
的DEPC水，放微波炉里溶化。
2）待冷却到60摄氏度左右时，加入1ml甲醛，摇匀（避免产生气泡）。倒入凝胶板上
凝固30min。
2．取各个RNA样品4µl，加入6×RNA电泳上样缓冲液2µl混匀，加入变性胶加样孔中。
3．120V电压下电泳25min。用凝胶紫外分析仪观察，照相保存。
4．RNA电泳结果如下图所示。可见28S和18S两条明亮条带，无DNA条带污染。
四．RNA反转录为cDNA
反转录程序(以MBI的M-MLV为例)组份加量(20ul体系)加量(40ul
体系)
模板(RNA)0.1~2.5ug(根据条带的亮度适当调整)3ug(根据条带的亮度适当调整)
引物T18(50uM)(或其他引物)2.0ul4.0ul
DEPC处理H2O至12.5ul至25ul
混匀，70℃5min，立即冰浴
5*buffer4.0ul8.0ul
dNTP(10mM)2.0ul4.0ul
RNaseInhibitor0.5ul1.0ul
混匀，37℃5min
M-MLV1.0ul2.0ul
42℃60min，70℃10min
反转录引物的选择与Real-TimePCR引物设计的要求
海纳百川，有容乃大；壁立千仞，无欲则刚。——林则徐
1）随机六聚体引物：
当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难以拷贝其全长序列时，可采用随机六聚
体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充
当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的
cDNA中96%来源于rRNA。
2）Oligo(dT)：
是一种仅对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3端Poly(A+)尾，此引物与
其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA只占总RNA的1-4%，故此种引物合
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