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高效液相色谱基础知识;;一、系统组成;
二、准备
;
;四、参数设定
;对于柱塞杆外部,做完样品后也必须用去离子水冲洗20ml以上。
3、配制样品和标准溶液(也可在平衡系统时配制),用合适的滤膜过滤。
3、建立色谱操作方法,注意保存为自己命名的Method,勿覆盖或删除他人的方法及实验结果;
用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化柱
3、流动相比例设定:在A泵显示初始屏幕时,按[conc]键,用数字键输入流动相B的浓度百分数,按[Enter]键确认。
连接点降至最低,对所有连接点作合适调整,尽可能采用细内径的连接管
更换无互溶性的流动相时要用异丙醇过渡一下。
4:用数字键输入停止时间,重复按[func]键直至屏幕显示STOP,按[Enter]键。
更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品
系统适用性实验:三个重要指标
方法:按A泵的[run]键,指示灯亮,梯度程序运行;
(注意腐蚀性与有机系的的溶剂)
①用含对照品的对照溶液所得色谱峰响应值,按下式计算比值(r):r=mr/Ar(其中mr和Ar分别为对照品的量和相应的峰面积或峰高。
系统适用性实验:三个重要指标
1、进样前按检测器[zero]键调零,按软件中[零点校正]按钮校正基线零点,再按一下[查看基线]按钮使其弹起。
2:检查各管路连接处是否漏液,如漏液应予以排除。;五、更换流动相并排气泡
;六、平衡系统
;六、平衡系统
;六、平衡系统
;七、进样;八、谱图的判断及结果计算;八、谱图的判断及结果计算;八、谱图的判断及结果计算;九、清洗管路及进样口;九、清洗管路及进样口;【特殊情况】:谱流路系统,从泵、进样器、色谱柱、到检测器通池,在分析完毕后,均应按()充分冲洗,特别是用过含盐流动相的,更应注意先用水,再用甲醇-水,充分冲洗。;谢谢大家!;第二节岛津LC-10AT型HPLC注意事项
;一、流动相;二、样品;三、色谱柱;三、色谱柱;四、操作过程;四、操作过程;四、操作过程;四、操作过程;四、操作过程;四、操作过程;自己总结的12条
注意事项;1、流动相必须用HPLC级的试剂,使用前过滤除去其中的颗粒??杂质和其他物质(使用或更细的膜过滤)。
2、流动相过滤后要用超声波脱气,脱气后应该恢复到室温后使用。
;3、不能用纯乙腈作为流动相,这样会使单向阀粘住而导致泵不进液。
4、使用缓冲溶液时,做完样品后应立即用去离子水冲洗管路及柱子一小时,然后用甲醇(或甲醇水溶液)冲洗40分钟以上,以充分洗去离子。对于柱塞杆外部,做完样品后也必须用去离子水冲洗20ml以上。
;;柱绝对不能进蛋白样品,血样、生物样品。
8.堵塞导致压力太大,按预柱→混合器中的过滤器→管路过滤器→单向阀检查并清洗。
清洗方法:①以异丙醇作溶剂冲洗;②放在异丙醇中间用超声波清洗;③用10%稀硝酸清洗。
;9.气泡会致使压力不稳,重现性差,所以在使用过程中要尽量避免产生气泡。
10.如果进液管内不进液体时,要使用注射器吸液:通常在输液前要进行流动相的清洗。
;11.要注意柱子的PH值范围,不得注射强酸强碱的样品,特别是碱性样品。
12.更换流动相时应该先将吸滤头部分放入烧杯中边振动边清洗,然后插入新的流动相中。更换无互溶性的流动相时要用异丙醇过渡一下。
;谢谢大家!;第三节高效液相色谱中常遇见的问题及处理方法;一、保留时间变化;二、保留时间缩短;三、保留时间延长;四?、出现肩峰或分叉;五、鬼峰;
六、基线噪声;七、峰拖尾
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